Protocol voor het ontwikkelen van een femur osteotomie model bij Wistar Albino ratten
Summary
Hier presenteren we een protocol om de schacht van het dijbeen van Wistar albinoratten iatrogenisch te breken en de ontwikkeling van het eelt op te volgen. Dit femur osteotomiemodel kan onderzoekers helpen het proces van fractuurgenezing te evalueren en te bestuderen hoe een medicijn de genezing van fracturen kan beïnvloeden.
Abstract
Fractuurgenezing is een fysiologisch proces dat resulteert in de regeneratie van botdefecten door de gecoördineerde werking van osteoblasten en osteoclasten. Osteoanabolische geneesmiddelen hebben het potentieel om het herstel van fracturen te vergroten, maar hebben beperkingen zoals hoge kosten of ongewenste bijwerkingen. Het botgenezend vermogen van een geneesmiddel kan in eerste instantie worden bepaald door in vitro studies, maar in vivo studies zijn nodig voor de uiteindelijke proof of concept. Ons doel was om een femur osteotomie knaagdiermodel te ontwikkelen dat onderzoekers zou kunnen helpen de ontwikkeling van eeltvorming na fractuur van de schacht van het dijbeen te begrijpen en dat zou kunnen helpen vaststellen of een potentieel medicijn botgenezende eigenschappen heeft. Volwassen mannelijke Wistar albino ratten werden gebruikt na goedkeuring van de Institutional Animal Ethics Committee. De knaagdieren werden verdoofd en onder aseptische omstandigheden werden volledige dwarse fracturen in het midden van een derde van de schachten van de dijbenen gemaakt met behulp van open osteotomie. De fracturen werden verminderd en intern gefixeerd met behulp van intramedullaire K-draden, en secundaire fractuurgenezing mocht plaatsvinden. Na de operatie werden intraperitoneale analgetica en antibiotica gedurende 5 dagen gegeven. Sequentiële wekelijkse röntgenfoto’s beoordeelden de eeltvorming. De ratten werden geofferd op basis van radiologisch vooraf bepaalde tijdspunten en de ontwikkeling van de fractuur callus werd radiologisch en met behulp van immunohistochemie geanalyseerd.
Introduction
Bot is een dicht bindweefsel dat bestaat uit botvormende cellen, de osteoblasten en botresorberende cellen, de osteoclasten. Fractuurgenezing is een fysiologisch proces dat resulteert in de regeneratie van botdefecten door de gecoördineerde werking van osteoblasten en osteoclasten1. Wanneer er een fractuur is, zijn osteoblastische en osteoclastische activiteit op de fractuurplaats enkele van de belangrijke factoren die de botgenezing bepalen2. Wanneer fractuurgenezing afwijkt van zijn normale beloop, resulteert dit in een vertraagde vereniging, malunion of nonunion. Van een fractuur wordt gezegd dat deze zich in non-union bevindt wanneer er gedurende 9 maanden een falen van de vereniging van de fractuur is, zonder progressie van herstel in de laatste 3 maanden3. Ongeveer 10%-15% van alle fracturen ondervindt een vertraging in het herstel die kan evolueren naar nonunion4. Het nonunionpercentage voor alle fracturen is 5% -10% en varieert afhankelijk van het betrokken bot en de plaats van fractuur5.
Het huidige regime voor de behandeling van fractuur nonunion omvat chirurgische en/of medische modaliteiten. Momenteel kan vertraagde of niet-bevestiging van fracturen worden overwonnen door chirurgische strategieën zoals bottransplantatie. Bottransplantatie heeft echter zijn beperkingen en complicaties zoals de beschikbaarheid van transplantaatweefsel, pijn op de donorplaats, morbiditeit en infectie6. Medische behandeling omvat osteoanabolische geneesmiddelen zoals botmorfogenetisch eiwit (BMP) en teriparatide (parathormone analoog). Momenteel gebruikte osteoanabolische middelen hebben het potentieel om het herstel van fracturen te vergroten, maar hebben beperkingen zoals exorbitante kosten of ongewenste bijwerkingen7. Daarom is er ruimte voor het identificeren van kosteneffectieve, niet-chirurgische alternatieven voor botgenezing. Het botgenezend vermogen van een geneesmiddel kan in eerste instantie worden bepaald door in vitro studies, maar in vivo studies zijn nodig voor de uiteindelijke proof of concept. Een geneesmiddel waarvan bekend is dat het de botgenezing verbetert, moet in vitro worden geëvalueerd en, indien veelbelovend bevonden, kan worden gebruikt voor in vivo diermodelstudies. Als het medicijn botvorming en remodellering in het in vivo model blijkt te bevorderen, kan het doorgaan naar de volgende fase (d.w.z. klinische onderzoeken).
Het beoordelen van fractuurgenezing bij dieren is een logische stap voorwaarts om een nieuw middel te evalueren dat is geïntroduceerd voor botgenezing voordat het menselijke proeven ondergaat. Voor in vivo diermodelstudies van fractuurgenezing zijn knaagdieren een steeds populairder model8 geworden. De knaagdiermodellen hebben steeds meer belangstelling gegenereerd vanwege de lage operationele kosten, de beperkte behoefte aan ruimte en minder tijd die nodig is voor botgenezing9. Bovendien hebben knaagdieren een breed spectrum van antilichamen en gendoelen, die studies mogelijk maken naar de moleculaire mechanismen van botgenezing en regeneratie10. Een consensusbijeenkomst belichtte uitgebreid verschillende botgenezingsmodellen voor kleine dieren en concentreerde zich op de verschillende parameters die van invloed zijn op botgenezing, evenals de nadruk op verschillende fractuurmodellen en implantaten voor kleine dieren11.
Basisbreukmodellen kunnen grofweg worden onderverdeeld in open of gesloten modellen. Gesloten fractuurmodellen gebruiken een drie- of vierpunts buigkracht op het bot en vereisen geen conventionele chirurgische aanpak. Ze leiden tot schuine of spiraalfracturen, die lijken op lange botbreuken bij mensen, maar het gebrek aan standaardisatie van fractuurlocatie en -afmetingen kan in hen als een verstorende factor werken12. Open fractuurmodellen vereisen chirurgische toegang voor osteotomie van het bot, helpen om een consistenter fractuurpatroon op de fractuurplaats te bereiken, maar worden geassocieerd met vertraagde genezing in vergelijking met de gesloten modellen13. De keuze van het bot dat wordt gebruikt om fractuurgenezing te bestuderen, blijft voornamelijk het scheenbeen en het dijbeen vanwege hun afmetingen en toegankelijkheid. De keuze van de plaats van de fractuur is meestal de diafyse of metafyse. Het metafysaire gebied wordt speciaal gekozen in gevallen waarin fractuurgenezing wordt bestudeerd bij osteoporotische proefpersonen, omdat de metafyse meer wordt beïnvloed door osteoporose14. Verschillende implantaten zoals intramedullaire pinnen en externe fixators kunnen worden gebruikt om de fractuur11,15 te stabiliseren.
Het doel van deze studie was om een eenvoudig en gemakkelijk te volgen knaagdiermodel te ontwikkelen dat onderzoekers niet alleen zou kunnen helpen de ontwikkeling van het eelt na een fractuur van het dijbeen te begrijpen, maar ook zou kunnen helpen bepalen of een potentieel medicijn botgenezende eigenschappen heeft door het mechanisme te begrijpen waarmee het werkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode beschrijft helder de details die nodig zijn om een fractuur osteotomiemodel te ontwikkelen bij Wistar albino ratten. Dit model kan worden gebruikt om het osteogene effect van een veelbelovend osteoanabolisch medicijn bij fractuurgenezing te evalueren en de fijne kneepjes van botgenezing te begrijpen. Het opvallende kenmerk van deze methode is dat het eenvoudig is en niet te veel tijd of geavanceerde apparatuur nodig heeft. In deze methode werden volwassen mannelijke Wistar albino ratten geselecteerd als het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de Centrale Raad voor Onderzoek in Homeopathie (CCRH), Ministerie van AYUSH, Govt. van India, bedanken voor onderzoeksfinanciering. De auteurs zijn dankbaar voor de hulp en steun van Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi, voor hun hulp en ondersteuning bij de dierproeven en CMET, AIIMS, New Delhi, voor hun hulp en ondersteuning bij fotografie en videografie.
Materials
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W. Assessment of compromised fracture healing. JAAOS – Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 20 (5), 273-282 (2012).
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -. M., Sioud, M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. , (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
