ヒツジの目の硝子体内注射
Summary
硝子体内注射は、ウイルス媒介遺伝子治療を網膜に送達することを目的として羊の目に行われました。
Abstract
網膜への治療薬の送達には、硝子体内(IVT)、網膜下、脈絡膜上、眼周囲、または局所投与を含むいくつかの方法があります。IVT薬物送達は、眼の後房を満たし、眼球の形状を維持するゼラチン状物質である眼の硝子体液への注射を含む。IVT経路は網膜下送達よりも特異的に標的化されていませんが、侵襲性ははるかに低く、さまざまな眼疾患の臨床現場で広く使用されています。
我々は以前、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介遺伝子治療製品(AAV9)の硝子体内送達の有効性を実証した。CLN5)は、天然に存在するCLN5型のニューロンセロイドリポフスチン症(NCL)を有するヒツジにおいて。罹患したヒツジは、片方の眼でIVT遺伝子治療を受け、もう片方の未治療の眼を内部対照とした。網膜の構造と機能は治療後15か月まで治療された眼で維持されましたが、未治療の眼は死後検査中に機能が徐々に低下し、重度の萎縮を示しました。ヒツジの研究に基づいて、CLN5遺伝子治療製品は、2021年9月に米国食品医薬品局によって候補治験新薬(IND)として認可されました。この論文では、治療用ウイルスベクターをヒツジの目にIVT送達するための外科的プロトコルについて詳しく説明します。
Introduction
硝子体内(IVT)、網膜下、脈絡膜上、眼周囲、または局所投与を含むいくつかの方法を網膜に送達するために使用することができる。各投与経路は、血液網膜関門または内外限界膜などの障壁を克服することを含み、送達される薬物および特定の網膜標的に応じて異なる有効性を有する1,2。
IVT薬物送達は、眼の後房を占めるゼラチン状物質である眼の硝子体液への注射を含む。硝子体液の主な機能は、眼球の形状を維持し、水晶体や網膜などの眼組織を所定の位置に保つことです。硝子体液は主に水で構成されており、少量のコラーゲン、ヒアルロン酸、およびその他の非コラーゲン性タンパク質が含まれています3。IVT注射は、加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、およびいくつかの遺伝性網膜ジストロフィーを含む幅広い眼の状態を治療するために日常的に使用される単純で一般的な手順です4,5。
ニューロンセロイドリポフスノース(NCL;バッテン病)は、脳および網膜の重度の変性を引き起こす致命的なリソソーム蓄積症のグループです。現在、さまざまな遺伝子(CLN1-8、CLN10-14)の突然変異に起因するNCLの既知の変異体は13あり、主に子供に影響を与えますが、発症年齢と病気の重症度はさまざまです6。NCLは、認知および運動機能の低下、発作、視力喪失などの一般的な進行性症状を共有しています。NCLの治療法はありません。しかし、脳指向酵素補充療法は現在、セロイドリポフスチック2疾患7,8の臨床試験中であり、AAVを介した遺伝子治療は前臨床試験で大きな期待が寄せられており、CLN5遺伝子治療の臨床試験は2022年に開始される予定です9,10。
他の多くの種は、猫、犬、羊、牛など、自然に発生する形のNCLを開発します。NCLの2つのヒツジモデルが現在ニュージーランドで活発に研究されています:ボーダーデール羊のCLN5病モデルとサウスハンプシャー羊のCLN6病モデル。罹患したヒツジは、網膜萎縮および視力喪失を含むヒト疾患の臨床的および病理学的特徴の多くを示す10,11。セプチリフスチノーシス5型シマチのヒツジにおける脳指向型セロイドリポフスチックリコウソリフスチックリコウセリフスチックリコチックリセリコチックリコチックリセリコウこれは、視力を維持し、より良い生活の質を維持するために網膜を治療する必要性を浮き彫りにし、羊の眼遺伝子治療のためのプロトコルの確立につながりました。
羊の目は、眼球の寸法、硝子体容積、および網膜構造の類似性により、人間の目の優れたモデルを表しています10、12、13。この論文では、少量の(≤100 μL)の治療用ウイルスベクターをヒツジの眼にIVT送達するための外科的プロトコルについて詳しく説明します。
Protocol
すべての実験プロトコルは、リンカーン大学の動物倫理委員会によって承認され、研究における動物の世話と使用に関する米国国立衛生研究所のガイドラインとニュージーランド動物福祉法(1999)に準拠しています。ボーダーデール羊は14 歳の出生時に診断され、リンカーン大学の研究農場で飼育されていました。生後3ヶ月のホモ接合型(CLN5-/-)雌羊3頭にIVTを1回注射?…
Representative Results
セロイドリポフスチ NCLのヒツジの網膜機能障害および変性を減弱させるCLN5遺伝子治療ベクターのIVT送達の有効性は、この研究グループ15によって以前に実証されています。罹患したヒツジは、AAV血清型9(AAV9)ベクター(AAV9)にパッケージされたCLN5の100μLIVT注射を単回受けた。CLN5)を片方の眼に挿入し、反対側の眼を未治療の内部コントロールとして機能させる。視力は、注射?…
Discussion
硝子体内注射は、ヒト眼科で最も一般的な外科的処置の1つであり、AAVを介した遺伝子治療を羊の網膜に送達するのに効果的であることが証明されています。我々は以前、AAV9の有効性を実証していた。セロイドリポフスチノーシス5遺伝子治療は、セロイドリポフスチ セリフスチの網膜機能障害および変性を弱めるために硝子体内に実施されました。この投与経路をヒトNCL患…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Steve Heap博士(BVSc、CertVOphthal)がこのプロトコルを確立し、Murrayらによって記述された注射を実行するのを支援したことに感謝したいと思います15。著者らはまた、CureKids New Zealand、Canterbury Medical Research Foundation、Neurogene Inc、およびBatten Disease Support and Research Associationからの資金提供にも感謝している。
Materials
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
Riferimenti
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -. E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -. Y., Kim, S. -. W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -. M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -. M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
Citazione di questo articolo
Murray, S. J., Mitchell, N. L. Intravitreal Injections in the Ovine Eye. J. Vis. Exp. (185), e63823, doi:10.3791/63823 (2022).