Inyecciones intravítreas en el ojo ovino
Summary
Se realizaron inyecciones intravítreas en el ojo de oveja con el objetivo de administrar terapia génica mediada por virus a la retina.
Abstract
Existen varios métodos para la administración de agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que llena la cámara posterior del ojo y mantiene la forma del globo ocular. Aunque la vía IVT es menos específica que la administración subretiniana, es mucho menos invasiva y se usa ampliamente en entornos clínicos para una variedad de enfermedades oculares.
Anteriormente demostramos la eficacia de la administración intravítrea de un producto de terapia génica mediado por virus adenoasociados (AAV) (AAV9). CLN5) en ovejas con una forma CLN5 natural de lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL). Las ovejas afectadas recibieron terapia génica IVT en un ojo, con el otro ojo no tratado sirviendo como control interno. La estructura y función de la retina se mantuvieron en el ojo tratado hasta 15 meses después del tratamiento, mientras que el ojo no tratado mostró una función progresivamente decreciente y atrofia severa durante el examen postmortem. Sobre la base de los estudios con ovejas, el producto de terapia génica CLN5 fue aprobado como un nuevo fármaco candidato en investigación (IND) por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos en septiembre de 2021. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un vector viral terapéutico al ojo ovino.
Introduction
Se pueden usar varios métodos para administrar agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. Cada vía de administración implica superar barreras como la barrera sangre-retina o las membranas limitantes internas y externas y tiene tasas variables de eficacia dependiendo del fármaco que se administra y del objetivo retiniano específico 1,2.
La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que ocupa la cámara posterior del ojo. La función principal del humor vítreo es mantener la forma del globo ocular y mantener los tejidos oculares, como el cristalino y la retina, en su lugar. El humor vítreo está compuesto principalmente de agua, con pequeñas cantidades de colágeno, ácido hialurónico y otras proteínas no colágenas3. La inyección de IVT es un procedimiento simple y común utilizado rutinariamente para tratar una amplia gama de afecciones oculares, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, el edema macular diabético, la retinopatía diabética, la oclusión de la vena retiniana y varias distrofias retinianas hereditarias 4,5.
Lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL; Enfermedad de Batten) son un grupo de enfermedades mortales de almacenamiento lisosomal que causan una degeneración grave del cerebro y la retina. Actualmente hay 13 variantes conocidas de NCL resultantes de mutaciones en diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afectan predominantemente a los niños, pero tienen diferentes edades de inicio y gravedad de la enfermedad6. Las NCL comparten síntomas progresivos comunes, que incluyen deterioro cognitivo y motor, convulsiones y pérdida de la visión. No hay cura para la NCL; sin embargo, la terapia de reemplazo enzimático dirigida al cerebro se encuentra actualmente en ensayos clínicos para la enfermedad CLN27,8, y la terapia génica mediada por AAV ha demostrado ser muy prometedora en estudios preclínicos, con un ensayo clínico para la terapia génica CLN5 que se espera que comience en 2022 9,10.
Muchas otras especies desarrollan formas naturales de NCL, incluyendo gatos, perros, ovejas y vacas. Dos modelos ovinos de NCL están actualmente en estudio activo en Nueva Zelanda: un modelo de enfermedad CLN5 en ovejas de Borderdale y un modelo de enfermedad CLN6 en ovejas de South Hampshire. Las ovejas afectadas presentan muchas de las características clínicas y patológicas de la enfermedad humana, incluyendo atrofia retiniana y pérdida de visión10,11. Aunque la terapia génica CLN5 dirigida al cerebro en ovejas con enfermedad CLN5 puede prevenir o detener la atrofia cerebral y el deterioro clínico, las ovejas tratadas aún pierden su visión9. Esto puso de manifiesto la necesidad de tratar la retina para preservar la visión y mantener una mejor calidad de vida, lo que llevó al establecimiento de un protocolo para la terapia génica ocular en ovejas.
El ojo de oveja representa un buen modelo del ojo humano debido a su similitud en las dimensiones del globo ocular, volumen vítreo y estructura retiniana10,12,13. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un pequeño volumen (≤100 μL) de vector viral terapéutico al ojo ovino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las inyecciones intravítreas son uno de los procedimientos quirúrgicos más comunes en oftalmología humana y han demostrado ser eficaces en la administración de terapias génicas mediadas por AAV a la retina de las ovejas. Anteriormente habíamos demostrado la eficacia de AAV9. La terapia génica CLN5 administrada intravítreamente atenuando la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL15. Se espera que la traducción de esta vía de administración a pacientes humanos con…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) por su ayuda en el establecimiento de este protocolo y la realización de las inyecciones descritas por Murray et al.15. Los autores también reconocen la financiación de CureKids New Zealand, la Fundación de Investigación Médica de Canterbury, Neurogene Inc y la Asociación de Apoyo e Investigación de la Enfermedad de Batten.
Materials
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
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