Iniezioni intravitreali nell'occhio ovino

Summary

Le iniezioni intravitreali sono state eseguite nell’occhio di pecora con l’obiettivo di fornire la terapia genica mediata da virus alla retina.

Abstract

Esistono diversi metodi per la somministrazione di agenti terapeutici alla retina, tra cui la somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. La somministrazione di farmaci IVT comporta un’iniezione nell’umore vitreo dell’occhio, una sostanza gelatinosa che riempie la camera posteriore dell’occhio e mantiene la forma del globo oculare. Sebbene la via IVT sia meno mirata rispetto alla somministrazione sottoretinica, è molto meno invasiva ed è ampiamente utilizzata in ambito clinico per una serie di malattie oculari.

Abbiamo precedentemente dimostrato l’efficacia della somministrazione intravitreale di un prodotto di terapia genica mediato da virus adeno-associati (AAV) (AAV9). CLN5) in pecore con una forma naturale CLN5 di ceroide lipofuscinosi neuronale (NCL). Le pecore affette hanno ricevuto la terapia genica IVT in un occhio, con l’altro occhio non trattato che funge da controllo interno. La struttura e la funzione retinica sono state mantenute nell’occhio trattato fino a 15 mesi dopo il trattamento, mentre l’occhio non trattato ha mostrato una funzione progressivamente in declino e una grave atrofia durante l’esame post mortem. Sulla base degli studi sulle pecore, il prodotto di terapia genica CLN5 è stato approvato come nuovo farmaco sperimentale candidato (IND) dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti nel settembre 2021. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo chirurgico per la somministrazione IVT di un vettore virale terapeutico all’occhio ovino.

Introduction

Diversi metodi possono essere utilizzati per fornire agenti terapeutici alla retina, tra cui somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. Ogni via di somministrazione comporta il superamento di barriere come la barriera emato-retina o le membrane limitanti interne ed esterne e ha tassi di efficacia variabili a seconda del farmaco somministrato e del bersaglio retinico specifico ^1,2.

La somministrazione di farmaci IVT comporta un’iniezione nell’umore vitreo dell’occhio, una sostanza gelatinosa che occupa la camera posteriore dell’occhio. La funzione primaria dell’umore vitreo è quella di mantenere la forma del globo oculare e mantenere i tessuti oculari, come la lente e la retina, in posizione. L’umore vitreo è composto in gran parte da acqua, con piccole quantità di collagene, acido ialuronico e altre proteine non collagene³. L’iniezione IVT è una procedura semplice e comune utilizzata di routine per trattare una vasta gamma di condizioni oculari, tra cui la degenerazione maculare legata all’età, l’edema maculare diabetico, la retinopatia diabetica, l’occlusione venosa retinica e diverse distrofie retiniche ereditarie ^4,5.

Ceroidolipofuscinosi neuronale (NCL; Malattia di Batten) sono un gruppo di malattie da accumulo lisosomiale fatali che causano una grave degenerazione del cervello e della retina. Attualmente sono note 13 varianti di NCL derivanti da mutazioni in diversi geni (CLN1-8, CLN10-14) che colpiscono prevalentemente i bambini ma hanno diverse età di insorgenza e gravità della malattia⁶. Le NCL condividono sintomi progressivi comuni, tra cui declino cognitivo e motorio, convulsioni e perdita della vista. Non esiste una cura per NCL; tuttavia, la terapia enzimatica sostitutiva diretta al cervello è attualmente in studi clinici per la malattia CLN2^7,8 e la terapia genica mediata da AAV ha mostrato grandi promesse negli studi preclinici, con una sperimentazione clinica per la terapia genica CLN5 che dovrebbe iniziare nel 2022 ^9,10.

Molte altre specie sviluppano forme naturali di NCL, tra cui gatti, cani, pecore e mucche. Due modelli ovini di NCL sono attualmente in fase di studio attivo in Nuova Zelanda: un modello di malattia CLN5 nelle pecore di Borderdale e un modello di malattia CLN6 nelle pecore del South Hampshire. Le pecore colpite presentano molte delle caratteristiche cliniche e patologiche della malattia umana, tra cui l’atrofia retinica e la perdita della vista^10,11. Sebbene la terapia genica CLN5 diretta al cervello nelle pecore con malattia CLN5 possa prevenire o arrestare l’atrofia cerebrale e il declino clinico, le pecore trattate perdono ancora la vista⁹. Ciò ha evidenziato la necessità di trattare la retina per preservare la vista e mantenere una migliore qualità della vita, portando alla creazione di un protocollo per la terapia genica oculare negli ovini.

L’occhio di pecora rappresenta un buon modello dell’occhio umano grazie alla sua somiglianza nelle dimensioni del globo oculare, nel volume vitreo e nella struttura retinica^10,12,13. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo chirurgico per la somministrazione IVT di un piccolo volume (≤100 μL) di vettore virale terapeutico all’occhio ovino.

Protocol

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico degli animali della Lincoln University e sono in linea con le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l’uso degli animali nella ricerca e il New Zealand Animal Welfare Act (1999). Le pecore di Borderdale sono state diagnosticate alla nascita14 e mantenute nelle fattorie di ricerca della Lincoln University. Tre pecore omozigoti di 3 mesi (CLN5-/-) hanno ricevuto una singola iniez…

Representative Results

L’efficacia della somministrazione IVT di un vettore di terapia genica CLN5 nell’attenuare la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL è stata precedentemente dimostrata da questo gruppo di ricerca15. Le pecore affette hanno ricevuto una singola iniezione IVT da 100 μL di CLN5 confezionata in un vettore AAV sierotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) in un occhio, con l’occhio controlaterale che funge da controllo interno non trattato. La vista è stata valutata mensilmente dall’et?…

Discussion

Le iniezioni intravitreali sono una delle procedure chirurgiche più comuni nell’oftalmologia umana e si sono dimostrate efficaci nel fornire terapie geniche mediate da AAV alla retina delle pecore. In precedenza avevamo dimostrato l’efficacia di AAV9. La terapia genica CLN5 è stata somministrata per via intravitreale attenuando la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL¹⁵. Si spera che anche la traduzione di questa via di somministrazione ai pazienti con NCL umani si riv…

Materials

1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115