Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio
Summary
Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l’analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.
Abstract
L’interesse per la microscopia a elettroni liquidi (liquid-EM) è salito alle stelle negli ultimi anni, poiché gli scienziati possono ora osservare i processi in tempo reale su scala nanometrica. È estremamente desiderabile accoppiare informazioni crio-EM ad alta risoluzione con osservazioni dinamiche poiché molti eventi si verificano su scale temporali rapide – nell’intervallo di millisecondi o più velocemente. Una migliore conoscenza delle strutture flessibili può anche aiutare nella progettazione di nuovi reagenti per combattere i patogeni emergenti, come SARS-CoV-2. Ancora più importante, la visualizzazione di materiali biologici in un ambiente fluido offre uno sguardo unico delle loro prestazioni nel corpo umano. Qui sono presentati metodi recentemente sviluppati per studiare le proprietà su scala nanometrica degli assemblaggi di virus nel ghiaccio liquido e vetroso. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati campioni ben definiti come sistemi modello. Vengono presentati confronti affiancati dei metodi di preparazione dei campioni e delle informazioni strutturali rappresentative. Le caratteristiche sub-nanometriche sono mostrate per le strutture risolte nell’intervallo di ~ 3,5-Å-10 Å. Altri risultati recenti che supportano questo quadro complementare includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini e delle terapie basate su anticorpi visualizzate in liquido. Nel complesso, queste applicazioni correlate migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per il loro uso nella salute umana e nelle malattie.
Introduction
La ricerca biomedica migliora la nostra comprensione della salute umana e delle malattie attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie. L’imaging ad alta risoluzione sta trasformando la nostra visione del nanomondo, permettendoci di studiare cellule e molecole in dettaglio squisito 1,2,3,4,5. Le informazioni statiche di componenti dinamici come polimeri molli, assemblaggi proteici o virus umani rivelano solo un’istantanea limitata della loro complessa narrazione. Per comprendere meglio come operano le entità molecolari, la loro struttura e funzione devono essere studiate congiuntamente.
I recenti progressi nella produzione di materiali come il grafene atomicamente sottile o i microchip a base di silicio offrono nuove opportunità per l’analisi struttura-funzione in tempo reale utilizzando microscopi elettronici a trasmissione (TEM). Questi materiali possono creare camere ermeticamente sigillate per l’imaging EM live 6,7,8,9,10,11. Il nuovo campo di liquido-EM, la temperatura ambiente correlata alla crio-EM, fornisce una visione senza precedenti di materiali duri o morbidi in soluzione, consentendo agli scienziati di studiare simultaneamente la struttura e la dinamica del loro campione. Le applicazioni liquid-EM includono registrazioni in tempo reale di nanoparticelle terapeutiche che interagiscono con le cellule staminali tumorali e cambiamenti nelle complessità molecolari dei patogeni virali12,13,14.
Proprio come i progressi metodologici hanno stimolato la rivoluzione della risoluzione nel campo della crio-EM, sono necessarie nuove tecniche e metodi per estendere l’uso di liquid-EM come strumento ad alto rendimento per la comunità scientifica. L’obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di semplificare i protocolli di preparazione dei campioni liquidi-EM. La logica alla base delle tecniche sviluppate è quella di impiegare nuovi progetti di microchip e dispositivi di autoloader, adatti sia per la raccolta di dati liquidi che crio-EM (Figura 1) 7,14,15,16,17. I gruppi sono sigillati meccanicamente utilizzando clip a griglia standard per strumenti automatizzati, come Krios, che possono ospitare più campioni per sessione o un TEM F200C (Figura 2). Questa metodologia espande l’uso dell’imaging ad alta risoluzione oltre le applicazioni crio-EM standard, dimostrando scopi più ampi per l’analisi dei materiali in tempo reale.
Nell’attuale articolo video, vengono presentati i protocolli per la preparazione di assemblaggi di virus in liquido con e senza portacampioni disponibili in commercio. Utilizzando il portacampioni specializzato per liquido-EM, i campioni liquidi sottili possono fornire informazioni strutturali paragonabili ai campioni crio-EM, nonché approfondimenti dinamici dei campioni. Vengono inoltre dimostrati metodi per la preparazione di campioni liquidi utilizzando strumenti di caricamento automatico per routine ad alta produttività. Il vantaggio principale rispetto ad altre tecniche è che la produzione automatizzata di campioni consente all’utente di valutare rapidamente i propri campioni per lo spessore e il dosaggio di elettroni ottimali prima della raccolta dei dati. Questa tecnica di screening identifica rapidamente le aree ideali per le registrazioni in tempo reale in liquido o ghiaccio12,14,18,19. Ai fini della determinazione della struttura 3D, liquid-EM può integrare i metodi crio-EM di lunga data implementati nella crio-EM. I lettori che impiegano tecnologie TEM o crio-EM convenzionali possono prendere in considerazione l’utilizzo di flussi di lavoro liquid-EM per fornire nuove osservazioni dinamiche dei loro campioni in un modo che integri le loro attuali strategie.
I campioni di virus utilizzati in questo protocollo includono il sottotipo 3 del virus adeno-associato purificato (AAV) ottenuto come dono e coltivato in condizioni standard12. Sono stati utilizzati anche assemblaggi subvirali non infettivi di SARS CoV-2 derivati dal siero di pazienti COVID-1912 e ottenuti da una fonte commerciale. Infine, le particelle purificate a doppio strato (DLP) del rotavirus delle scimmie (ceppo SA11) sono state ottenute dal laboratorio della dottoressa Sarah M. McDonald Esstman presso la Wake Forest University e coltivate utilizzando condizioni standard 6,17. I pacchetti software qui descritti sono disponibili gratuitamente e i collegamenti sono stati forniti nella sezione Tabella dei materiali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vengono presentate nuove opportunità per semplificare gli attuali flussi di lavoro liquid-EM utilizzando nuovi strumenti automatizzati e tecnologie adattate dal campo crio-EM. Le applicazioni che coinvolgono la nuova tecnica a sandwich di microchip sono significative rispetto ad altri metodi perché consentono l’analisi di imaging ad alta risoluzione in ghiaccio liquido o vetroso. Uno dei passaggi più critici del protocollo è la produzione di campioni con lo spessore liquido ideale per visualizzare dettagli squisiti a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Dipartimento di Oftalmologia) per aver fornito AAV-3 purificato. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health e dal National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
Riferimenti
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
