Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду
Summary
Здесь описаны протоколы для подготовки вирусных сборок, пригодных для жидкостно-ЭМ и крио-ЭМ анализа на наноуровне с использованием просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Интерес к жидкостно-электронной микроскопии (liquid-EM) резко возрос в последние годы, поскольку ученые теперь могут наблюдать процессы в режиме реального времени на наноуровне. Крайне желательно сочетать крио-ЭМ-информацию высокого разрешения с динамическими наблюдениями, так как многие события происходят в быстрых временных масштабах – в миллисекундном диапазоне или быстрее. Улучшенные знания о гибких структурах также могут помочь в разработке новых реагентов для борьбы с новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Что еще более важно, просмотр биологических материалов в жидкой среде дает уникальное представление об их производительности в организме человека. Здесь представлены недавно разработанные методы исследования наноразмерных свойств вирусных сборок в жидком и стекловидном льду. Для достижения этой цели в качестве модельных систем использовались четко определенные образцы. Представлены параллельные сравнения методов пробоподготовки и репрезентативной структурной информации. Субнанометровые особенности показаны для структур, разрешенных в диапазоне ~3,5-Å-10 Å. Другие недавние результаты, которые поддерживают эту дополнительную структуру, включают динамическое понимание кандидатов на вакцину и терапии на основе антител, изображенной в жидкости. В целом, эти коррелятивные приложения повышают нашу способность визуализировать молекулярную динамику, обеспечивая уникальный контекст для их использования в здоровье человека и болезнях.
Introduction
Биомедицинские исследования улучшают наше понимание здоровья человека и болезней путем разработки новых технологий. Визуализация с высоким разрешением трансформирует наш взгляд на наномир, позволяя нам изучать клетки и молекулы в мельчайших деталях 1,2,3,4,5. Статическая информация о динамических компонентах, таких как мягкие полимеры, белковые сборки или человеческие вирусы, показывает лишь ограниченный снимок их сложного повествования. Чтобы лучше понять, как работают молекулярные объекты, их структура и функция должны быть совместно исследованы.
Последние достижения в производстве таких материалов, как атомарно тонкий графен или микрочипы на основе кремния, предоставляют новые возможности для анализа структуры и функции в режиме реального времени с использованием просвечивающих электронных микроскопов (TEM). Эти материалы могут создавать герметично закрытые камеры для живой ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11. Новое поле жидкости-ЭМ, комнатная температура коррелирует с крио-ЭМ, обеспечивает беспрецедентные представления твердых или мягких материалов в растворе, позволяя ученым одновременно изучать структуру и динамику их образца. Приложения Liquid-EM включают записи в реальном времени терапевтических наночастиц, взаимодействующих с раковыми стволовыми клетками, а также изменения в молекулярных тонкостях вирусных патогенов 12,13,14.
Так же, как методологические достижения стимулировали революцию разрешения в области крио-ЭМ, необходимы новые методы и методы для расширения использования жидкой ЭМ в качестве высокопроизводительного инструмента для научного сообщества. Общая цель методов, представленных здесь, заключается в оптимизации протоколов подготовки образцов жидкостной ЭМ. Обоснование разработанных методов заключается в использовании новых конструкций микрочипов и устройств автозагрузки, подходящих как для сбора жидкостных, так и крио-ЭМ данных (рисунок 1)7,14,15,16,17. Сборки механически герметизированы с использованием стандартных сетчатых зажимов для автоматизированных приборов, таких как Krios, которые могут вмещать несколько образцов за сеанс или F200C TEM (рисунок 2). Эта методология расширяет использование изображений с высоким разрешением за пределы стандартных крио-ЭМ-приложений, демонстрируя более широкие цели для анализа материалов в режиме реального времени.
В текущей видеостатье представлены протоколы подготовки вирусных сборок в жидкости с коммерчески доступными держателями образцов и без них. Использование специализированного держателя образцов для жидких ЭМ, тонких жидких образцов может предоставить структурную информацию, сопоставимую с крио-ЭМ-образцами, а также динамическое понимание образцов. Также продемонстрированы методы подготовки жидких образцов с использованием инструментов автозагрузчика для высокопроизводительных процедур. Основным преимуществом по сравнению с другими методами является то, что автоматизированное производство образцов позволяет пользователю быстро оценивать свои образцы для оптимальной толщины и дозировки электронов до сбора данных. Этот метод скрининга быстро определяет идеальные области для записи в реальном времени в жидкости или льду 12,14,18,19. Для целей 3D-определения структуры жидкость-ЭМ может дополнять давно устоявшиеся крио-ЭМ методы, реализованные в крио-ЭМ. Читатели, использующие обычные технологии ТЕА или крио-ЭМ, могут рассмотреть возможность использования рабочих процессов жидкостной ЭМ для обеспечения новых, динамических наблюдений за своими образцами таким образом, чтобы дополнить их текущие стратегии.
Образцы вирусов, используемые в этом протоколе, включают очищенный аденоассоциированный вирус подтипа 3 (AAV), полученный в качестве подарка и культивируемый в стандартных условиях12. Также использовались неинфекционные СУБВИРУСНЫЕ сборки SARS CoV-2, полученные из сыворотки 12 пациентов сCOVID-19 и полученные из коммерческого источника. Наконец, очищенные обезьяньи ротавирус (штамм SA11) двухслойные частицы (DLP) были получены из лаборатории доктора Сары М. Макдональд Эссен в Университете Уэйк Форест и культивированы с использованием стандартных условий 6,17. Пакеты программного обеспечения, описанные здесь, находятся в свободном доступе, а ссылки были предоставлены в разделе «Таблица материалов».
Protocol
Representative Results
Discussion
Открываются новые возможности для оптимизации текущих рабочих процессов жидкостной ЭМ за счет использования новых автоматизированных инструментов и технологий, адаптированных из области крио-ЭМ. Приложения, связанные с новой технологией сэндвичей с микрочипами, важны по сравнению с…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность доктору Луку Х. Ванденберге (Гарвардская медицинская школа, отделение офтальмологии) за предоставление очищенного AAV-3. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения и Национальным институтом рака (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 до D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
Riferimenti
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
