Avance de imágenes de alta resolución de ensamblajes de virus en líquido y hielo
Summary
Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.
Abstract
El interés en la microscopía de electrones líquidos (EM líquido) se ha disparado en los últimos años, ya que los científicos ahora pueden observar procesos en tiempo real a nanoescala. Es extremadamente deseable combinar la información crio-EM de alta resolución con observaciones dinámicas, ya que muchos eventos ocurren en escalas de tiempo rápidas, en el rango de milisegundos o más rápido. Un mejor conocimiento de las estructuras flexibles también puede ayudar en el diseño de nuevos reactivos para combatir patógenos emergentes, como el SARS-CoV-2. Más importante aún, ver materiales biológicos en un ambiente fluido proporciona una visión única de su rendimiento en el cuerpo humano. Aquí se presentan métodos recientemente desarrollados para investigar las propiedades a nanoescala de los ensamblajes de virus en hielo líquido y vítreo. Para lograr este objetivo, se utilizaron muestras bien definidas como sistemas modelo. Se presentan comparaciones lado a lado de los métodos de preparación de muestras e información estructural representativa. Las características subnanométricas se muestran para estructuras resueltas en el rango de ~ 3.5-Å-10 Å. Otros resultados recientes que respaldan este marco complementario incluyen información dinámica de candidatos a vacunas y terapias basadas en anticuerpos fotografiadas en líquido. En general, estas aplicaciones correlativas mejoran nuestra capacidad de visualizar la dinámica molecular, proporcionando un contexto único para su uso en la salud y la enfermedad humanas.
Introduction
La investigación biomédica mejora nuestra comprensión de la salud humana y la enfermedad a través del desarrollo de nuevas tecnologías. Las imágenes de alta resolución están transformando nuestra visión del nanomundo, permitiéndonos estudiar células y moléculas con exquisito detalle 1,2,3,4,5. La información estática de componentes dinámicos como polímeros blandos, ensamblajes de proteínas o virus humanos revela solo una instantánea limitada de su compleja narrativa. Para comprender mejor cómo operan las entidades moleculares, su estructura y función deben investigarse conjuntamente.
Los avances recientes en la producción de materiales como el grafeno atómicamente delgado o los microchips basados en silicio brindan nuevas oportunidades para el análisis estructura-función en tiempo real utilizando microscopios electrónicos de transmisión (TEM). Estos materiales pueden crear cámaras herméticamente selladas para imágenes EM en vivo 6,7,8,9,10,11. El nuevo campo de EM líquido, la temperatura ambiente correlacionada con la crio-EM, proporciona vistas sin precedentes de materiales duros o blandos en solución, lo que permite a los científicos estudiar simultáneamente la estructura y la dinámica de su muestra. Las aplicaciones de EM líquida incluyen registros en tiempo real de nanopartículas terapéuticas que interactúan con células madre cancerosas, así como cambios en las complejidades moleculares de los patógenos virales12,13,14.
Así como los avances metodológicos estimularon la revolución de la resolución en el campo de la crioelectroEM, se necesitan nuevas técnicas y métodos para extender el uso de la electroEM líquida como una herramienta de alto rendimiento para la comunidad científica. El objetivo general de los métodos presentados aquí es simplificar los protocolos de preparación de muestras EM líquidas. La razón detrás de las técnicas desarrolladas es emplear nuevos diseños de microchips y dispositivos de carga automática, adecuados para la recolección de datos líquidos y crioelectromagnéticos (Figura 1)7,14,15,16,17. Los conjuntos se sellan mecánicamente utilizando clips de rejilla estándar para instrumentos automatizados, como el Krios, que puede acomodar múltiples muestras por sesión o un TEM F200C (Figura 2). Esta metodología amplía el uso de imágenes de alta resolución más allá de las aplicaciones crio-EM estándar, lo que demuestra propósitos más amplios para el análisis de materiales en tiempo real.
En el artículo de video actual, se presentan protocolos para preparar ensamblajes de virus en líquido con y sin portamuestras disponibles comercialmente. Utilizando el portamuestras especializado para EM líquido, las muestras líquidas delgadas pueden proporcionar información estructural comparable a las muestras crio-EM, así como información dinámica de las muestras. También se demuestran métodos para preparar muestras líquidas utilizando herramientas de carga automática para rutinas de alto rendimiento. La principal ventaja sobre otras técnicas es que la producción automatizada de muestras permite al usuario evaluar rápidamente sus muestras para el grosor óptimo y la dosificación de electrones antes de la recopilación de datos. Esta técnica de cribado identifica rápidamente las zonas ideales para grabaciones en tiempo real en líquido o hielo12,14,18,19. A efectos de la determinación de la estructura 3D, la EM líquida puede complementar los métodos crioelectromagnéticos establecidos desde hace mucho tiempo implementados en la crioelectroemia. Los lectores que emplean tecnologías TEM o crio-EM convencionales pueden considerar el uso de flujos de trabajo de EM líquida para proporcionar observaciones nuevas y dinámicas de sus muestras de una manera que complemente sus estrategias actuales.
Las muestras de virus utilizadas en este protocolo incluyen el virus adenoasociado purificado subtipo 3 (AAV) obtenido como regalo y cultivado en condiciones estándar12. También se utilizaron ensamblajes subvirales no infecciosos del SARS CoV-2 derivados del suero de pacientes con COVID-1912 y obtenidos de una fuente comercial. Finalmente, se obtuvieron partículas de doble capa (DLP) purificadas del rotavirus simio (cepa SA11) del laboratorio de la Dra. Sarah M. McDonald Esstman de la Universidad de Wake Forest y se cultivaron utilizando condiciones estándar 6,17. Los paquetes de software descritos aquí están disponibles gratuitamente y los enlaces se han proporcionado en la sección Tabla de materiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presentan nuevas oportunidades para agilizar los flujos de trabajo actuales de EM líquida mediante el uso de nuevas herramientas automatizadas y tecnologías adaptadas del campo crioelectromagnético. Las aplicaciones que involucran la nueva técnica de sándwich de microchip son significativas con respecto a otros métodos porque permiten el análisis de imágenes de alta resolución en hielo líquido o vítreo. Uno de los pasos más críticos en el protocolo es producir especímenes con el espesor de líquido ideal…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen al Dr. Luk H. Vandenberghe (Escuela de Medicina de Harvard, Departamento de Oftalmología) por proporcionar AAV-3 purificado. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto Nacional del Cáncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
Riferimenti
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