Fremme af højopløsningsbilleddannelse af virussamlinger i væske og is
Summary
Her beskrives protokoller til fremstilling af virussamlinger, der er egnede til væske-EM- og kryo-EM-analyse på nanoskala ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi.
Abstract
Interessen for flydende elektronmikroskopi (liquid-EM) er steget kraftigt i de senere år, da forskere nu kan observere realtidsprocesser på nanoskala. Det er yderst ønskeligt at parre højopløselig cryo-EM-information med dynamiske observationer, da mange begivenheder forekommer på hurtige tidsskalaer – i millisekundområdet eller hurtigere. Forbedret viden om fleksible strukturer kan også hjælpe med at designe nye reagenser til bekæmpelse af nye patogener, såsom SARS-CoV-2. Endnu vigtigere er det, at se biologiske materialer i et flydende miljø giver et unikt glimt af deres præstationer i menneskekroppen. Her præsenteres nyudviklede metoder til at undersøge nanoskalaegenskaberne af virussamlinger i flydende og glasagtig is. For at nå dette mål blev veldefinerede prøver brugt som modelsystemer. Side om side sammenligninger af prøveforberedelsesmetoder og repræsentative strukturelle oplysninger præsenteres. Sub-nanometer funktioner er vist for strukturer løst i området ~ 3,5-Å-10 Å. Andre nylige resultater, der understøtter denne komplementære ramme, omfatter dynamisk indsigt i vaccinekandidater og antistofbaserede terapier, der er afbildet i væske. Samlet set fremmer disse korrelative applikationer vores evne til at visualisere molekylær dynamik, hvilket giver en unik kontekst for deres anvendelse i menneskers sundhed og sygdom.
Introduction
Biomedicinsk forskning forbedrer vores forståelse af menneskers sundhed og sygdom gennem udvikling af nye teknologier. Billeddannelse i høj opløsning ændrer vores syn på nanoverdenen – hvilket gør det muligt for os at studere celler og molekyler i udsøgte detaljer 1,2,3,4,5. Statisk information om dynamiske komponenter såsom bløde polymerer, proteinsamlinger eller humane vira afslører kun et begrænset øjebliksbillede af deres komplekse fortælling. For bedre at forstå, hvordan molekylære enheder fungerer, skal deres struktur og funktion undersøges i fællesskab.
Nylige fremskridt inden for produktion af materialer som atomtynd grafen eller siliciumbaserede mikrochips giver nye muligheder for strukturfunktionsanalyse i realtid ved hjælp af transmissionselektronmikroskoper (TEM’er). Disse materialer kan skabe hermetisk lukkede kamre til levende EM-billeddannelse 6,7,8,9,10,11. Det nye felt af væske-EM, stuetemperaturen korrelerer med cryo-EM, giver hidtil usete visninger af hårde eller bløde materialer i opløsning, så forskere samtidig kan studere strukturen og dynamikken i deres prøve. Liquid-EM-applikationer inkluderer realtidsoptagelser af terapeutiske nanopartikler, der interagerer med kræftstamceller samt ændringer i de molekylære forviklinger af virale patogener12,13,14.
Ligesom metodologiske fremskridt ansporede opløsningsrevolutionen inden for cryo-EM-feltet, er der behov for nye teknikker og metoder for at udvide brugen af væske-EM som et værktøj med høj kapacitet for det videnskabelige samfund. Det overordnede mål med de metoder, der præsenteres her, er at strømline protokoller til forberedelse af flydende EM-prøver. Rationalet bag de udviklede teknikker er at anvende nye mikrochipdesign og autoloader-enheder, der er egnede til både væske- og cryo-EM-dataindsamling (figur 1)7,14,15,16,17. Samlingerne forsegles mekanisk ved hjælp af standardgitterklip til automatiserede instrumenter, såsom Krios, som kan rumme flere prøver pr. session eller en F200C TEM (figur 2). Denne metode udvider brugen af billeddannelse i høj opløsning ud over standard cryo-EM-applikationer, der demonstrerer bredere formål til materialeanalyse i realtid.
I den aktuelle videoartikel præsenteres protokoller til fremstilling af virussamlinger i væske med og uden kommercielt tilgængelige prøveholdere. Ved hjælp af den specialiserede prøveholder til væske-EM kan tynde væskeprøver give strukturelle oplysninger, der kan sammenlignes med cryo-EM-prøver, samt dynamisk indsigt i prøverne. Også demonstreret er metoder til forberedelse af flydende prøver ved hjælp af autoloaderværktøjer til rutiner med høj kapacitet. Den største fordel i forhold til andre teknikker er, at automatiseret prøveproduktion giver brugeren mulighed for hurtigt at vurdere deres prøver for optimal tykkelse og elektrondosering inden dataindsamling. Denne screeningsteknik identificerer hurtigt ideelle områder til realtidsoptagelser i væske eller is12,14,18,19. Med henblik på bestemmelse af 3D-struktur kan liquid-EM supplere de veletablerede cryo-EM-metoder, der er implementeret i cryo-EM. Læsere, der anvender konventionelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan overveje at bruge flydende EM-arbejdsgange til at give nye, dynamiske observationer af deres prøver på en måde, der supplerer deres nuværende strategier.
Virusprøver, der anvendes i denne protokol, omfatter oprenset adeno-associeret virussubtype 3 (AAV) opnået som gave og dyrket under standardbetingelser12. Der blev også anvendt ikke-infektiøse SARS CoV-2 subvirale samlinger afledt af serum fra COVID-19-patienter12 og opnået fra en kommerciel kilde. Endelig blev oprensede simian rotavirus (SA11 stamme) dobbeltlagspartikler (DLP’er) opnået fra laboratoriet af Dr. Sarah M. McDonald Esstman ved Wake Forest University og dyrket ved hjælp af standardbetingelser 6,17. Softwarepakker, der er beskrevet her, er frit tilgængelige, og linkene er angivet i afsnittet Materialetabel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der præsenteres nye muligheder for at strømline nuværende liquid-EM-arbejdsgange ved hjælp af nye automatiserede værktøjer og teknologier tilpasset cryo-EM-feltet. Anvendelser, der involverer den nye mikrochipsandwichteknik, er vigtige i forhold til andre metoder, fordi de muliggør billeddannelsesanalyse i høj opløsning i flydende eller glasagtig is. Et af de mest kritiske trin i protokollen er at producere prøver med den ideelle væsketykkelse til at visualisere udsøgte detaljer på nanoskalaniveau. Ideelle o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) for at levere renset AAV-3. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health og National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 til D.F.K.).
Materials
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 Liter |
| Autoloader clipping tool | ThermoFisher Scientific | N/A | Also SubAngstrom supplier |
| Autoloader grid clips | ThermoFisher Scientific | N/A | top and bottom clips |
| Carbon-coated gold EM grids | Electron Microcopy Sciences | CF400-AU-50 | 400-mesh, 5-nm thickness |
| COVID-19 patient serum | RayBiotech | CoV-Pos-S-500 | 500 microliters of PCR+ serum |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 Liter |
| Microwell-integrad microchips | Protochips, Inc. | EPB-42A1-10 | 10×10-mm window arrays |
| TEMWindows microchips | Simpore Inc. | SN100-A10Q33B | 9 large windows, 10-nn thick |
| TEMWindows microchips | Simpore, Inc. | SN100-A05Q33A | 9 small windows, 5-nm thick |
| Top microchips | Protochips, Inc. | EPT-50W | 500 mm x 100 mm window |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Equipment | |||
| DirectView direct electron detector | Direct Electron | 6-micron pixel spacing | |
| Falcon 3 EC direct electron detector | ThermoFisher Scientific | 14-micron pixel spacing | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| Mark IV Vitrobot | ThermoFisher Scientific | state-of-the-art specimen preparation unit | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Poseidon Select specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible;specimen holder | |
| Talos F200C TEM | ThermoFisher Scientific | 200 kV; Liquid-TEM | |
| Titan Krios G3 | ThermoFisher Scientific | 300 kV; Cryo-TEM | |
| Freely available software | Website link | Comments (optional) | |
| cryoSPARC | https://cryosparc.com/ | other image processing software | |
| CTFFIND4 | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | CTF finding program | |
| MotionCorr2 | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | ||
| RELION | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page | ||
| SerialEM | https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | ||
| UCSF Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | molecular structure analysis software package |
Riferimenti
- Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
- Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- DiMaio, F., et al. Atomic accuracy models from 4.5 Å cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement. Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).
- Frank, J., et al. A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome. Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).
- Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. In situ TEM of biological assemblies in liquid. Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).
- Dearnaley, W. J., et al. Liquid-cell electron tomography of biological systems. Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).
- Park, J., et al. Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy. Communications Chemistry. 1, 80 (2018).
- Jonaid, G., et al. High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets. Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).
- Pohlmann, E. S., et al. Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells. Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).
- Jonaid, G. M., et al. Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid. Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).
- Varano, A. C., et al. Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).
- Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
- Tanner, J. R., et al. Cryo-SiN – An alternative substrate to visualize active viral assemblies. Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).
- Solares, M. J., et al. Microchip-based structure determination of disease-relevant p53. Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).
- Casasanta, M. A., et al. Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy. Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).
- Mastronarde, D. N. Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM. Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera—A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion. Virology. 403 (1), 26-36 (2010).
- Sharma, G., et al. Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome. Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).
- Kiss, G., et al. Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications. Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices—a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184 (4132), 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object. Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186 (4162), 407-414 (1974).
- Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet proteins: Catalase. Science. 177 (4045), 268-270 (1972).
