Rening och kvalitetskontroll av rekombinanta septinkomplex för cellfri beredning

Summary

In vitro-rekonstitution av cytoskelettproteiner är ett viktigt verktyg för att förstå de grundläggande funktionella egenskaperna hos dessa proteiner. Denna uppsats beskriver ett protokoll för att rena och bedöma kvaliteten på rekombinanta septinkomplex, som spelar en central roll i celldelning och migration.

Abstract

Septiner är en familj av konserverade eukaryota GTP-bindande proteiner som kan bilda cytoskelettfilament och högre ordningsstrukturer från hetero-oligomera komplex. De interagerar med andra cytoskelettkomponenter och cellmembranet för att delta i viktiga cellulära funktioner som migration och celldelning. På grund av komplexiteten i septinernas många interaktioner, det stora antalet septingener (13 hos människor) och septinernas förmåga att bilda hetero-oligomera komplex med olika subenhetskompositioner, är cellfri rekonstitution en viktig strategi för att förstå grunderna i septinbiologi. Denna uppsats beskriver först en metod för att rena rekombinanta septiner i deras hetero-oligomera form med hjälp av en tvåstegs affinitetskromatografimetod. Därefter beskrivs processen för kvalitetskontroll som används för att kontrollera renheten och integriteten hos septinkomplexen. Denna process kombinerar inbyggd och denaturerande gelelektrofores, negativ fläckelektronmikroskopi och interferometrisk spridningsmikroskopi. Slutligen ges en beskrivning av processen för att kontrollera polymerisationsförmågan hos septinkomplex med användning av negativ fläckelektronmikroskopi och fluorescerande mikroskopi. Detta visar att det är möjligt att producera högkvalitativa humana septinhexamerer och oktamerer som innehåller olika isoformer av septin_9, liksom Drosophila septinhexamerer.

Introduction

Cytoskelettet har klassiskt beskrivits som ett trekomponentsystem bestående av aktinfilament, mikrotubuli och mellanliggande filament 1, men nyligen har septiner erkänts som en fjärde komponent i cytoskeletten¹. Septiner är en familj av GTP-bindande proteiner som bevaras i eukaryoter². Septiner är involverade i många cellulära funktioner såsom celldelning³, cell-celladhesion⁴, cellmotilitet⁵, morfogenes⁶, cellulär infektion⁷ och etablering och underhåll av cellpolaritet⁸. Trots deras viktiga funktioner är hur septiner är involverade i sådana processer dåligt förstådda.

Septinfamiljen av proteiner är indelad i flera undergrupper (fyra eller sju, beroende på klassificeringen) baserat på proteinsekvenslikhet². Medlemmar av olika underfamiljer kan bilda palindromiska hetero-oligomera komplex, som är byggstenarna i filament och som i sin tur monteras i högre ordningsstrukturer såsom buntar, ringar och nätverk 1,9,10,11,12. Ytterligare molekylär komplexitet uppstår genom närvaron av olika skarvvarianter, ett exempel är human SEPT9, där det finns bevis för specifika funktioner hos olika skarvvarianter^13,14,15. Dessutom beror längden på hetero-oligomererna på art och celltyp. Till exempel bildar Caenorhabditis elegans septiner tetramerer¹⁶, Drosophila melanogaster septiner bildar hexamerer 17 (figur 1A), Saccharomyces cerevisiae septiner bildar oktamerer¹⁸ och mänskliga septiner bildar både hexamerer och oktamerer¹⁹ (figur ^1A). Förmågan hos septinisoformer, skarvvarianter och post-translationellt modifierade septiner från samma underfamilj att ersätta varandra i komplexet och (sam)existensen av hetero-oligomerer av olika storlek har gjort det svårt att avgränsa cellfunktionerna hos olika hetero-oligomera komplex¹².

En annan intressant förmåga hos septiner är deras förmåga att interagera med många bindande partners i cellen. Septiner binder plasmamembranet och membranorganellerna under interfas och celldelning^20,21,22. I delande celler samarbetar septiner med anillin 23,24,25 och aktin och myosin under cytokinese ^26,27. I de sena stadierna av cytokinese verkar septiner reglera de endosomala sorteringskomplexen som krävs för transportsystemet (ESCRT) för abscission av mellankroppen²⁸. Dessutom finns det också bevis på septin som ligger på aktinbarken och aktinstressfibrerna i celler i interfasceller 29,30,31. I specifika celltyper binder och reglerar septiner också mikrotubulicytoskelettet^32,33.

Alla dessa funktioner gör septiner till ett mycket intressant proteinsystem att studera, men också ett utmanande. Kombinationen av det stora antalet septinunderenheter (13 gener hos människor utan att räkna skarvvarianter²) med potentialen hos septinunderenheter från samma underfamilj att ersätta varandra och bilda hetero-oligomerer av olika storlek gör det svårt att dra en slutsats om cellfunktionen hos en specifik septin genom genetisk manipulation. Dessutom gör de många interaktionerna mellan septiner att tolka effekterna av vanliga forskningsverktyg som läkemedel³⁴ riktade mot cytoskelett- eller membrankomponenter till en svår uppgift.

Ett sätt att övervinna denna situation är att komplettera forskningen i celler med in vitro (cellfri) rekonstituering av septiner. In vitro-rekonstitution möjliggör isolering av en enda typ av septin hetero-oligomerer med en specifik subenhetssammansättning och längd 18,35,36,37. Detta komplex kan sedan studeras i en kontrollerad miljö, antingen ensam för att upptäcka de grundläggande strukturella och fysikalisk-kemiska egenskaperna hos septiner 38,39,40, eller i kombination med önskade partners såsom modellbiomembraner ^11,41,42, aktinfilament ^10,27 eller mikrotubuli ^32,36 för att dechiffrera arten av deras Interaktioner.

Därför är en pålitlig metod för att rena olika septinkomplex effektivt avgörande för septinforskning. Men även med samma protokoll kan olika reningar ge proteiner med olika aktivitet/funktionalitet eller till och med integritet. För kommersiellt tillgängliga proteiner såsom enzymer valideras funktionaliteten och den enzymatiska aktiviteten noggrant⁴³. Att genomföra noggrann kvalitetskontroll för cytoskelettala eller strukturella proteiner som septiner kan vara utmanande, men det är viktigt att göra experiment över laboratorier jämförbara.

Denna uppsats beskriver en robust metod för att rena högkvalitativa rekombinanta septiner i deras hetero-oligomera form baserat på samtidig expression av två vektorer innehållande mono- eller bi-cistroniska konstruktioner (tabell 1) i Escherichia coli-celler. Metoden består av en tvåstegs affinitetskromatografimetod för att fånga septin hetero-oligomerer innehållande både en_{hans 6-taggade} septin och en Strep-II-taggad septin (figur 1B,C). Detta protokoll, som först beskrevs i Iv et al.10, har använts för att rena Drosophila septinhexamerer 11,27,35, humana septinhexamerer 10 och flera humana septinoktamerer som innehåller olika infödda (isoform 1, 3 och 5)^10,32 eller muterade SEPT9-isoformer ³² . Vidare ges en beskrivning av en uppsättning tekniker för att bedöma kvaliteten på de renade septinerna. Först kontrolleras integriteten och den korrekta stökiometrin hos septinunderenheterna med hjälp av denatureringselektrofores och transmissionselektronmikroskopi (TEM). Därefter undersöks närvaron av hetero-oligomerer med rätt molekylmassa och närvaron av monomerer eller mindre oligomerer som indikerar komplex instabilitet genom inbyggd elektrofores och massfotometri via interferometrisk spridningsmikroskopi (iSCAT). Slutligen består det sista steget av bedömningen av septinernas polymeriserande aktivitet med användning av fluorescensmikroskopi och TEM.

Figur 1: Reningsstrategi . (A) Scheman för septin hetero-oligomerer som finns i mänskliga (vänster) och Drosophila (höger) celler. Siffror betecknar septinunderenheter från de angivna grupperna, och P betecknar jordnöt. Mänsklig SEPT9 kan vara någon av dess isoformer. Septinunderenheterna har en asymmetrisk form och är längsgående associerade med två distinkta gränssnitt, NC: NC och G: G-gränssnittet, som betecknas med NC respektive G, ovanpå den mänskliga hexameren. (B,C) Schematisk illustration av tvåstegskromatografistrategin, visad för (B) humana septinhexamerer och (C) oktamerer. H anger his-taggarna, medan S anger Strep-II-taggarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Rening av septin hetero-oligomerer Samtransformation av bakterieceller med uttrycksvektorernaVälj en kombination av en pnEA och en pnCS plasmid44 som ska användas för uttryck. Välj kombination beroende på önskad underenhetssammansättning av septin hetero-oligomeren10,35 och på om fluorescerande märkning krävs eller inte.OBS: C-terminalt taggad monomerisk supermapp GFP (msfGFP)-taggad SEPT2 (för humana septiner) eller msfGFP- eller monomerisk förbättrad GFP (mEGFP)-DSep2 (för Drosophila septiner) används här (tabell 1). Pipettera 1 μl av varje plasmid (~1 ng/μl) till 100 μl av kompetenta BL21 Escherichia coli-celler och inkubera på is i 20 minuter. Placera cellerna i ett vattenbad vid 42 °C i 40 s och inkubera dem sedan omedelbart i 3 minuter på is. Tillsätt 0,9 ml lysogent buljongmedium (LB) till cellsuspensionen och låt cellerna växa i 1 timme vid 37 °C. Platta 100 μl celler på varma LB-agarplattor innehållande 100 μg/ml ampicillin och 100 μg/ml spektinomycin och inkubera över natten vid 37 °C. Odla bakteriell förkulturFyll en 250 ml Erlenmeyerkolv med 100 ml fantastisk buljong (TB) eller LB-medium som innehåller 100 μg/ml ampicillin och 100 μg/ml spektinomycin. Välj ut en enda koloni från LB-agarplattan med en steril inokuleringsslinga och överför den till färska medier från steg 1.2.1. Inkubera vid 37 °C i en roterande skakinkubator, antingen över natten eller i minst 6 timmar.OBS: Från denna kultur kan en glycerolstam framställas genom att blanda bakteriesuspensionen 1:1 med glycerol och lagras vid −80 °C. Detta lager kan användas i steg 1.2.2. istället för en nyförvandlad koloni. Induktion av bakteriekultur och proteinuttryckÖverför 100 ml odlade bakterier till 5 liter TB eller LB innehållande 50 μg / ml ampicillin och 50 μg / ml spektinomycin. Odla denna kultur vid 37 °C i en skakinkubator tills den når en optisk densitet (OD) uppmätt vid en våglängd på 600 nm i intervallet 2-3 för omärkta septiner eller 0,6-0,8 för msfGFP/mEGFP-märkta septiner och inducera proteinuttryck genom att tillsätta en slutlig koncentration på 0,5 mM IPTG. Den lägre OD för de märkta septinerna är att undvika att nå dödsfasen under deras längre uttryckstid, som beskrivs i nästa steg. Inkubera cellerna som uttrycker omärkta septin hetero-oligomerer i 3 timmar vid 37 °C eller cellerna som uttrycker msfGFP-märkta hetero-oligomerer över natten vid 17 °C.OBS: Den korta proteinuttryckstiden för omärkta komplex, som underlättas av användningen av det rikare TB-mediet, väljs för att förhindra proteinnedbrytning. Den längre uttryckstiden i kombination med lägre temperatur för märkta komplex väljs för att möjliggöra korrekt vikning av msfGFP-taggen. Bakteriell lys och lysatförtydligandeOBS: Från och med denna tidpunkt i reningsförfarandet, förvara den proteininnehållande lösningen alltid på is eller vid 4 °C för att förhindra nedbrytning av proteolytiskt protein eller förlust av aktivitet.Samla upp de odlade cellerna genom centrifugering vid 4 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten.Alternativt kan du snäppfrysa pelleten i detta steg och förvara vid −80 °C i högst 6 månader. Om detta alternativ väljs, se till att tina pelleten på is innan du fortsätter. Lös upp pelleten i 100 ml lysbuffert (tabell 2) och lysera cellerna. Välj ett av de två alternativen nedanSonicate i 7 cykler av 30 s PÅ och 59 s OFF med en tips sonicator med 30% amplitud (observera att inställningarna är sonicator-beroende). Bryt ner cellerna i den franska pressen genom att skicka dem minst 3x. Klargör celllysatet genom att centrifugera vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 °C och behåll supernatanten. Det rekommenderas att börja med steg 1.5.1. under detta centrifugalsteg. Ta eventuellt ett prov för denaturering av elektrofores, enligt beskrivningen i avsnitt 2. Affinitetskromatografi för His-märkta proteinerOBS: Detta steg ger komplex som innehåller human SEPT2 eller Drosophila Sep1 med hjälp av en nickelkolonn (figur 1B).Balansera en färdigpackad nickelsefasos högpresterande kromatografikolonn med septinbuffert (tabell 2). Lasta den klarade supernatanten på kolonnen vid 1 ml/min och tvätta det bundna proteinet med minst tre kolonnvolymer septinbuffert. Eluera septinkomplexen med 50% HisTrap-elueringsbuffert (tabell 2) vid 1 ml / min medan du samlar 0,5 ml fraktioner för att ge en imidazolkoncentration på 250 mM. Välj fraktionerna som innehåller septinkomplex, vilket indikeras av eluatets optiska absorbans vid 280 nm övervakad online med ett snabbt proteinvätskekromatografi (FPLC) -system eller efter rening med en mikrovolymspektrofotometer.OBS: Imidazol absorberar ljus vid 280 nm. Detta förklarar förmodligen varför proteintoppen inte går tillbaka till noll absorbans efter septin-elueringen (figur 2A). Affinitetskromatografi för Strep-II-märkta proteinerOBS: Detta steg ger komplex som innehåller antingen human SEPT7 (hexamerer), human SEPT9 (oktamerer) eller Drosophila jordnöt med hjälp av en Strep-Tactin-kolonn (figur 1B). Kromatografikolonnen är baserad på ett modifierat biotin-streptavidinsystem. Proteinet är märkt med modifierat biotin (Strep-II-tag), och kolonnen innehåller ett konstruerat streptavidin (Strep-Tactin). Trots att det modifierats från biotin-streptavidin-systemet finns det ingen störning mellan Strep-Tactin-Strep-II-tag-systemet och biotin-streptavidin-systemet. Det beskrivna systemet används för att undvika störningar i rekonstitueringsanalyser med biotin och streptavidin.Balansera en färdigpackad StrepTactin sepharose högpresterande kromatografikolonn med septinbuffert (tabell 2). Fyll på de septinhaltiga fraktioner som återvunnits från nickelkolonnen vid 1 ml/min och tvätta det bundna proteinet med minst tre kolonnvolymer septinbuffert. Eluera septinkomplexen med 100% StrepTrap-elueringsbuffert (tabell 2) vid 1 ml / min medan du samlar 0,5 ml fraktioner för att ge en koncentration av 2,5 mM destiobiotin.OBS: Desthiobiotin i StrepTrap-elueringsbufferten måste lösas upp färskt. Välj fraktionerna som innehåller septinkomplex, vilket indikeras av eluatets optiska absorbans vid 280 nm övervakad online med ett FPLC-system eller efter rening med en mikrovolymspektrofotometer.OBS: Denatureringselektroforesen görs vanligtvis vid denna tidpunkt med prover av kolonntvättarna och septinfraktionerna. Kolumnernas ordning kan inverteras med oskiljbara resultat, dvs det förtydligade lysatet efter steg 1.4. kan utsättas för Strep-Tactin affinitetskromatografi följt av nickelaffinitetskromatografi. Dialys och förvaringFör att avlägsna desthiobiotin från den slutliga lagringslösningen, dialysera septinkomplexen i ett ~ 1:300 prov-till-buffertvolymförhållande mot septinbuffert (tabell 2) kompletterat med 1 mM DTT över natten, eller i minst 4 timmar, vid 4 ° C med användning av ett 30 kDa MWCO-dialysmembran. Koncentrera eventuellt septinerna med en 30 kDa MWCO centrifugalkoncentrationskolonn upp till önskad koncentration. Sikta på en koncentration på 5–7 μM, mätt via lösningens optiska absorbans vid 280 nm och med hjälp av en teoretisk extinktionskoefficient beräknad via ProtParam (tabell 3). Alikvotera proteinkomplexen till önskad alikvotstorlek, snäppfrys alikvoten och förvara den vid −80 °C.OBS: Det rekommenderas att inte lagra proteinet i mer än 6 månader. Dessutom rekommenderas att utföra regelbundna kvalitetskontrollexperiment, speciellt om proteinet lagras längre än den rekommenderade tiden. 2. Kvalitetskontroll av renhet och integritet hos septin hetero-oligomeren OBS: Hetero-oligomerkvalitetskontrollen består av en uppsättning biokemiska och avbildningstekniker som möjliggör detektering av massan och integriteten hos septinkomplexen som finns i lösningen. Denaturerande elektrofores för att kontrollera bildandet av septin hetero-oligomeren med rätt komponenterBlanda 10 μL av de valda fraktionerna med 10 μL 2x SDS-provbuffert, ladda dem på en prefabricerad 4% -15% TGX-gel och fyll systemet med Tris / glycin / SDS-löpande buffert. Kör elektroforesen i 35 min vid 200 V och färga gelén (materialtabellen) för att visualisera resultaten. Molekylvikterna för de enskilda septinproteinerna och septin hetero-oligomera komplexen finns i tabell 3. Mät den relativa intensiteten för varje band inuti varje körfält som innehåller renade septiner i en kontrastinverterad bild. Gör detta genom att beräkna medelintensiteten för lika stora rektanglar runt varje band och för en lika stor rektangel på ett område utan något band i samma körfält. Normalisera sedan värdena genom att dividera intensiteten för varje band med intensiteten i regionen utan band.Om intensiteten är mättad (till exempel värden på 255 för en 8-bitarsbild på en kontrastinverterad bild) hoppar du över körfältet. Ensemble-genomsnittlig inhemsk storleksfördelning via inbyggd elektroforesFörbered 800 ml anodbuffert och 200 ml ljusblå katodbuffert dagen innan och förvara dem i kylen. För att förbereda anodbufferten, späd 40 ml 20x löpande buffert med 760 ml typ I-avjoniserat vatten (I-vatten). För att förbereda den ljusblå katodbufferten, späd 10 ml 20x löpande buffert och 1 ml 20x katodadditiv med 189 ml I-vatten. Löpbufferten och katodadditivet levereras med ett kit (Materialtabell). Bered 10 μL av provet genom att blanda ~ 500 ng septin med den nödvändiga mängden provbuffert (2,5 μL i detta fall på grund av användningen av en 4x provbuffert; se Materialtabell) och tillräckligt med I-vatten för att nå en volym på 10 μL. Ladda proverna på gelén och fyll systemet med de iskalla anod- och katodbuffertarna. Kör elektroforesen i cirka 115 min vid 150 V med en strömförsörjning som inte stannar vid låga strömmar och fläckar gelén (materialtabellen) för att visualisera resultaten. Molekylvikterna för de enskilda proteinerna och komplexen beräknade baserat på sekvensen finns i tabell 3. Massfördelning med en molekyl med massfotometri via interferometrisk spridningsmikroskopiTvätta # 1.5 glasskivor genom att sonikera dem i en ultraljudsrengörare i 5 min i I-vatten, 5 min i isopropanol och slutligen 5 min i I-vatten. Torka två glasskivor med en mild ström av kvävgas och placera en 7 μL droppe på 0,01% Poly-L-lysin (PLL) lösning på mitten av en av bilderna. Placera sedan mitten av den andra bilden ovanpå PLL-droppen och orientera de två bilderna ortogonalt för enkel separation. Inkubera i 30 s.Tvätta genom att nedsänka i en bägare med I-vatten 1x och genom att direkt applicera en ström av I-vatten 2x. Torka sedan de två bilderna med ett flöde av kvävgas. Dessa bilder kan förvaras efteråt i cirka 6 veckor vid rumstemperatur under torra förhållanden.Märk den sida av bilden som behandlas med PLL för att köra experimentet korrekt. Strax före experimentet, skär en bit av 2 x 2, 3 x 2 eller 3 x 3 packningar (som ger 4, 6 respektive 9 bildkammare / bild) och fäst den på den PLL-behandlade delen av en glasskiva samtidigt som du undviker att glasskivan och packningarna kommer i kontakt med någon smutsig yta. Placera bilden på en lätt torkarvävnad och tryck på packningarna med en pipettspets för att fästa dem med den skyddande plasten som fortfarande finns på packningarna. Värm septinbufferten (tabell 2) till rumstemperatur och tina proteinerna i handen (håll dem på is efteråt).OBS: iSCAT visar signalen från vissa tvättmedel och små molekyler som liknar proteinsignaler45. DTT är en av de små molekylerna, och det är därför den inte används för detta experiment. Det finns bara ett spår av DTT som kommer från den lagrade septinen. Placera bilden med packningar på det kommersiella massfotometrisystemet som innehåller 19 μL septinbuffert och fokusera mikroskopet med autofokusalternativet. Följ tillverkarens instruktioner för att kontrollera om det hittade fokuset är korrekt. Standard 100x-målet som ingår i installationen används här. Skapa eller läs in en projektmapp för att lagra data med hjälp av Arkiv > nytt projekt eller Fil > Läs in projekt. Pipettera 1 μL prov på 19 μl septinbuffertfall (steg 2.3.5) som används för att fokusera och blanda samtidigt som bildens rörelse minimeras genom att inte vidröra något medan du gör det. Spela sedan in en video med 6 000 bilder genom att klicka på Spela in.För korrekt analys, registrera följande prover: septinbuffert, proteinmassastandard för kalibrering av signal-till-mass-förhållandet (om en ny kalibrering är tillgänglig och miljöförhållandena inte har förändrats kan detta prov hoppas över) och 250 nM septinkomplex utspädda i septinbuffert utan DTT (detta ger en slutlig koncentration på ~ 12,5 nM). Analysera videorna med tillverkarens programvara för att få proteinmassfördelningen. Kontrollera om det finns data av god kvalitet enligt följande.Om topparna i olika septin hetero-oligomerstorlekar överlappar för mycket eller för många händelser upptäcks (>3 500 händelser för en video med 6 000 bildrutor med det vanliga synfältet på 128 pixlar x 34 pixlar som sträcker sig över 10,8 μm x 2,9 μm), minska den slutliga septinkoncentrationen och mät igen. Om det inte finns tillräckligt med antal enskilda molekyler uppmätta (minst 2 500-3 500 för en video med 6 000 bilder med det vanliga synfältet), öka septinkoncentrationen och mät igen. Direkt avbildning av septinkomplex via elektronmikroskopi med negativ fläcköverföringSpäd proverna till en koncentration av ca 50 nM i septinbuffert och bered färgningslösningen (2% uranylformiat eller uranylacetat i I-vatten).OBS: Uranylformiat måste beredas färskt. Pipettera 4 μL utspädda septiner på ett glödande urladdat elektronmikroskopigaller och inkubera i 30 s. Ta bort det mesta av proteinlösningen med ett filterpapper och tvätta gallret 2x med septinbuffert och 1x med I-vatten för att avlägsna löst adsorberade septiner. Fläcka med 2% uranylacetat eller uranylformiatlösning i I-vatten i 1 min, absorbera färgningslösningen med ett filterpapper och lufttorka gallret i några minuter. Screena rutnätet med ett korrekt justerat överföringselektronmikroskop för att söka efter regioner med förbättrad fläck och samla in cirka 100 bilder inom dessa valda områden. Samla bilder med en förstoring på minst 50 000x för att få en pixelstorlek på cirka 2 Å/pixel och med en defokusering som varierar från −1 μm till −2 μm. Använd en accelerationsspänning på 200 kV. Använd helst en automatiserad procedur för att samla in data, vilket beror på vilken förvärvsprogramvara som finns tillgänglig. Utför 2D-bildbehandling med dedikerad programvaraBoxa ut minst 2 000 partiklar med hjälp av en dedikerad programvara46. Utför tvådimensionell justering och klassificering iterativt tills klasser erhålls utan ytterligare förbättring. Det första justerings- och klassificeringssteget bör vara referensfritt för att undvika snedvridning i klassificeringen. Använd medelvärdena från den första referensfria klassificeringen som nya referenser för att utföra en extra klassificeringsrunda. Upprepa denna process iterativt tills ingen ytterligare förbättring uppnås. Se till att varje klass är baserad på 50 till 100 plockade partiklar, och enskilda underenheter är tydligt synliga. Olika mjukvaruverktyg kan användas (Spider, Eman eller Relion)46,47,48. 3. Septin funktionell kvalitetskontroll via polymerisationsanalys OBS: Funktionalitetskvalitetskontrollen består av en uppsättning bildtekniker som möjliggör detektering av polymeriserade septinkomplex. Nedan kallas omärkta septiner som “mörka” septiner, och bufferten som används för polymerisering av omärkta septiner kallas “mörk” septinpolymerisationsbuffert (SPB). Septinbuntavbildning via fluorescensmikroskopiBered 5x fluoSPB (tabell 2) och en septinblandning bestående av 90% mörk septin och 10% msfGFP-septin vid sex gånger högre koncentration än den önskade slutliga koncentrationen i septinbuffert + 1 mM DTT. En typisk koncentration för denna analys är 300 nM, och därför är koncentrationen 1 800 nM för denna blandning. Polymerisera septinet genom att blanda, i denna specifika ordning, I-vatten (tillräckligt för att fylla på till den slutliga önskade volymen), 20% 5xfluoSPB (en slutlig utspädning av 1:5), 0,05 μM PCD och 16,67% septinblandning (en slutlig utspädning av 1:6). För 10 μl, blanda 6,23 μl I-vatten, 2 μl 5xfluoSPB, 0,1 μL PCD (med en stam av 5 μM) och 1,67 μL septinblandning. Inkubera denna blandning i minst 30 minuter vid rumstemperatur. Lägg proverna i en bildkammare tvättad med fluoSPB (tabell 2) och avbilda septinbuntarna. PLL-PEG-passiverade flödeskanaler, som beskrivits i tidigare forskning10,32, fungerar bra för detta experiment. Septinbunt föreställer sig via negativ fläcköverföringselektronmikroskopiFörbered 5x darkSPB (tabell 2) och en septinblandning bestående av 100% mörk septin vid sex gånger högre koncentration än önskad slutlig koncentration i septinbuffert + 1 mM DTT. En typisk koncentration för denna analys är 300 nM, och därför är koncentrationen 1 800 nM för denna blandning. Polymerisera septinkomplexen genom att blanda, i denna specifika ordning, I-vatten (tillräckligt för att fylla på till den slutliga önskade volymen), 20% 5xdarkSPB och 16,67% septinblandning. För 5 μL, blanda 3,16 μL I-vatten, 1 μL 5x darkSPB och 0,83 μL septinblandning. Inkubera denna blandning i minst 30 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 3–5 μl prov i ett glödande elektronmikroskopinät och inkubera i 1 min. Tvätta sedan gallret 2x med darkSPB (tabell 2) genom att absorbera vätskan med ett filterpapper och tillsätt en droppe darkSPB-buffert, tvätta 1x med I-vatten, inkubera i ~ 30 s med 2% uranylacetat, torka fläcken och lufttorka provet i några minuter. Avbilda septinbuntarna vid 120 kV och förstoringar mellan 5 000x och 60 000x med en defokusering på mellan 1-2 μm.

Representative Results

Som nämnts i protokollet odlades 5 L E. coli-celler tillsammans med de två septinuttryckande plasmiderna, och uttrycket av septiner inducerades genom tillsats av IPTG. Efter 3 h samlades cellerna genom centrifugering, resuspenderades i lysbuffert och lyserades genom ultraljudsbehandling. Lysatet klargjordes sedan genom centrifugering och den klarade lösningen applicerades på en HisTrap-kolonn (figur 2A). Efter den första reningen slogs de septinhaltiga fraktionerna samman och applicerades på en StrepTrap-kolonn (figur 2B). Detta ger vanligtvis cirka 3-5 ml ~ 1 μM septinkomplex. Innan de septininnehållande fraktionerna samlas kan denatureringsgelelektrofores användas för att kontrollera integriteten hos septinunderenheterna och det ekvimolära stökiometriska förhållandet mellan de olika septinunderenheterna som bildar komplexet. (Figur 3A). Om gelén visar liknande intensiva band som motsvarar molekylvikterna (tabell 3) för septinunderenheterna kan protokollet fortsättas. Om inte, rekommenderas att starta protokollet igen. I exemplet som visas för mänsklig septinoktamer med SEPT9_i1 visar figur 3A tydligt band som motsvarar SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 och SEPT2 (i ordningen från topp till botten) med liknande intensiteter; 99% konfidensintervallet för den normaliserade intensiteten var 1,128 ± 0,048 för SEPT2, 1,092 ± 0,034 för SEPT6, 1,108 ± 0,040 för SEPT7 och 1,067 ± 0,029 för SEPT9. Om SEPT2 är taggad med msfGFP kommer den att flyttas upp mycket nära under SEPT9_i1. Beroende på vilket elektroforessystem som används och närvaron av den C-terminala TEV-Strep-taggen för SEPT7 (vilket gör att den migrerar långsammare än otaggad SEPT7), smälter SEPT7- och SEPT6-banden ibland samman på grund av deras jämförbara molekylvikter. Nästa steg är att slå ihop fraktionerna och dialysera dem mot septinbuffert med DTT. Efter dialysen, om koncentrationen är för låg (<2 μM) eller en högre koncentration behövs för experimenten, kan ett koncentrationssteg inkluderas, enligt beskrivningen i protokollet. Koncentrationer under 1 μM indikerar vanligtvis en dålig funktionell kvalitet hos septinerna. En slutlig septinkomplexkoncentration mellan 3,5 μM och 7 μM fungerar bra för de flesta in vitro-analyser . Dessa koncentrationer erhålls vanligtvis när volymen efter koncentration når 0,5-1 ml. Figur 2: Exempelkromatogram som motsvarar rening av mörk mänsklig septin octamers_9i1 . (A) HisTrap-kolonnkromatogram. Efter septin-elueringstoppen går absorbansen inte tillbaka till noll, troligen på grund av närvaron av imidazol i bufferten. Den poolade fraktionen gick från början av elueringstoppen tills absorbansen stabiliserades vid cirka 250 ml. B) StrepTrap-kolonnkromatogram. Den poolade fraktionen gick från början av elueringstoppen tills absorbansen gick tillbaka till cirka 0 vid 50 ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra. För att fortsätta med kvalitetskontrollen utfördes inbyggd elektrofores, som beskrivs i protokollet, (Figur 3B). I gelerna kan ett huvudband som motsvarar de intakta hetero-oligomererna och vanligtvis ett mindre band som motsvarar dimerer observeras. Mänskliga hexamerer finns lite ovanför 242 kDa-markörbandet, medan oktamerer finns ovanför 480 kDa-bandet, över deras beräknade molekylmassa. Placeringen av dessa band kontrollerades genom western blot-analys av eukaryota cellextrakt32. Taggning med msfGFP kopplar varje SEPT2 med ett msfGFP-protein. Detta orsakar en ökning av molekylvikten för septinkomplex på 53,4 kDa (26,7 kDa/msGFP-molekyl). På den ursprungliga elektroforesgelen är dock den uppenbara molekylvikten för de msfGFP-märkta komplexen oskiljbar från den för de omärkta komplexen. En kompletterande teknik för att testa om septinkomplexen är intakta är massfotometri med iSCAT-mikroskopi. iSCAT övervakar ljusspridningen av molekyler som landar på en glasskiva förstärkt av störningar i referensljuset, vanligtvis laserns reflektion på botten av glasskivan. Sedan används en bakgrundssubtraktionsmetod för att ge kontrast till partiklarna. På grund av denna korrigering visar signalen positiva och negativa värden beroende på om partiklarna landar på glaset eller rör sig bort från det49. Den detekterade signalen är direkt proportionell mot molekylvikten för proteiner50. Därför kan en signal-till-mass-kalibrering med en massstandard bestämma massan av provproteinerna. Figur 3C visar ett exempel på mänskliga septinoktamerer som innehåller SEPT9_i1. De flesta av de detekterade enskilda partiklarna (~ 50%) har en molekylvikt som förväntas för fullständiga oktamerer som innehåller SEPT9_i1 (423 kDa) (figur 3C). Det finns också partiklar med massor mellan 150-300 kDa, men ingen tydlig topp observeras, vilket indikerar eventuell närvaro av andra septinarter i låg mängd. På liknande sätt har de flesta detekterade enskilda partiklar för mEGFP-märkta Drosophila-hexamerer en molekylvikt som förväntas för intakta hexamerer (361 kDa) (figur 3D). En ytterligare tydlig topp vid 241 kDa indikerar närvaron av stabila tetramerer innehållande två jordnötsproteiner, en DSep1 och en mEGFP-DSep2. Slutligen visar både de mänskliga och flugseptinkomplexen en topp runt 80 kDa som kan vara en blandning av monomerer och dimerer, möjligen förstärkt av ett spår av DTT eller någon annan liten molekyl som aggregerar, vilket visar en topp i den positiva sidan av plot45. Figur 3: Exempel på resultat av oligomerkvalitetskontrollen. (A) Exempel på denatureringsgel som visar olika fraktioner av elueringstoppen från rening av mörk mänsklig septin octamers_9i1. (B) Exempel på inhemsk elektrofores av olika septinkomplex. (C,D) Olika exempel på histogramresultat av massfotometri vid 12,5 nM septinkomplex: (C) mörk mänsklig septin octamers_9i1 och (D) DSep1-msfGFP Drosophila septinhexamerer. Linjerna är gaussiska passningar. (E) TEM-bild av 25 nM mörk mänsklig septin octamers_9i1 i septinbuffert. Skalstreck = 200 nm. (F) Klassgenomsnittsbild av SEPT2-msfGFP humant septin octamers_9i1. msfGFP-taggarna är synliga som suddiga densiteter i de två ändarna. Skalstreck = 10 nm. Paneler (E) och (F) är upphovsrättsskyddade av The Company of Biologists och har anpassats från Iv et al.10 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Med tanke på att både infödda geler och iSCAT endast tillhandahåller ensemble-genomsnittlig information, användes klassmedelvärde av överföringselektronmikroskopibilder av enstaka septinoligomerer för att kontrollera komplexens integritet och renhet genom direkt visualisering. I TEM-bilder av septinkomplex i septinbuffert kan stavar med en längd på 24 nm (hexamerer) eller 32 nm (oktamerer) observeras. Ett exempel på en mänsklig septinoktamer som innehåller SEPT9_i1 kan ses i figur 3E. När klassen medelvärde för dem kan var och en av underenheterna observeras och räknas, vilket ses för den msfGFP-märkta mänskliga oktameren med SEPT9_i1 i figur 3F. Om oligomeren är fluorescerande märkt kan extra densiteter som motsvarar SEPT2-msfGFP observeras i slutet av stavarna (figur 3F). Kombinationen av ovanstående tekniker visar att oktamerer (eller hexamerer) med rätt stökiometriskt förhållande och hög renhet kan renas med användning av det beskrivna protokollet. Slutligen är den sista kvalitetskontrollen för septinkomplexens funktionalitet när det gäller deras polymerisationsförmåga. I närvaro av låg saltkoncentration (<150 mM KCl med den beskrivna bufferten 9), om septiner inte är i närvaro av andra proteiner eller negativt laddade lipidmembran, monteras de själv i buntar9. Septiner förhindras från polymerisation genom att hålla dem i lagringsbufferten, som har en hög (300 mM) KCl-koncentration. Septin hetero-oligomererna späds sedan med ett volymförhållande på 1:6 i en buffert av samma sammansättning men utan KCl för att uppnå en slutlig KCl-koncentration på 50 mM. För att göra fluorescensavbildning kompletteras denna buffert med ett syrerensningssystem för att skydda mot fotoblekning och med en blinkande suppressor. I TIRF-mikroskopi kan små kluster av proteiner observeras inom det grunda TIRF-fältet (~ 100 nm; Figur 4A,B). På ett konfokalmikroskop kan stora kluster av trådformiga strukturer ses flyta högre upp i lösningen (figur 4C). Slutligen, med TEM, kan små buntar av septin (figur 4D), som motsvarar de kluster som observerats av TIRF, och stora buntar (figur 4E), som motsvarar de strukturer som observerats med konfokalmikroskopi, observeras. Insatserna i figur 4D,E avslöjar att båda typerna av strukturer består av långa, tunna trådar som löper parallellt och bildar buntar med avsmalnande ändar. Tillsammans bevisar fluorescens- och TEM-bilderna att de renade septinkomplexen kan polymeriseras till filament, som i sin tur självmonteras i buntar. Figur 4: Exempel på resultat av kvalitetskontrollen av polymerisationsförmågan. (A) TIRF-bild av 300 nM humana septinhexamerer (10% msfGFP-märkta hexamerer) i fluoSPB. B) TIRF-bild av 300 nM humana septinoktamer innehållande SEPT9_i1 (10 % msfGFP-märkt octamers9_i1) i fluoSPB. (C) Konfokala projektioner med maximal intensitet av Z-stackar över ~ 30 μm med 0,5 μm avstånd på 300 nM humant septin octamers_9i3 i fluoSPB. (AC) Skalstreck = 10 μm och inverterad gråskala. (D,E) Exempel på TEM-bilder av (D) små och (E) stora buntar av mänsklig septin octamers_9i1 i darkSPB. Infällningar visar regioner där tydliga glödtrådar som löper parallellt i bunten kan observeras. Skalstänger = 500 nm. Paneler (C-E) är upphovsrättsskyddade av The Company of Biologists och har anpassats från Iv et al.10 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Tabell 1: Lista över plasmider. Plasmider för att rena septinoligomerer enligt detta protokoll. Alla plasmider har deponerats i Addgene (första kolumnen). Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 2: Förteckning över buffertar. Buffertkompositioner som används för rening och kvalitetskontroll av septinoligomerer. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 3: Molekylvikter och extinktionskoefficienter. Lista över molekylvikter (MW) och optiska extinktionskoefficienter (ε) vid en våglängd av 280 nm beräknad med ProtParam baserat på komplexets sekvenser, förutsatt linjär fusion av septinunderenheterna, de olika septinkomplexen och de unika septinunderenheterna (endast MW) som kan renas med plasmiderna som anges i tabell 1. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Metoden som beskrivs här möjliggör robust rening och kvalitetskontroll av förformade septin hetero-oligomerer. Några av de viktigaste frågorna att tänka på för korrekt tillämpning av metoden är följande. Under elueringsstegen i de kromatografiska separationerna är det viktigt att använda den rekommenderade (eller lägre) flödeshastigheten för att minimera utspädningen av septinkomplexen. För att maximera återhämtningen av protein under det slutliga koncentrationssteget är koncentratorkolonnen dessutom orienterad på ett sådant sätt att lösningen inte skjuts mot filtret (när det bara finns ett filter på ena sidan). Om lösningen går direkt till filtret, fastnar proteinet mycket mer på det, vilket väsentligt minskar det slutliga utbytet. Det är också viktigt att tänka på att koncentrationssteget inte alltid är nödvändigt. Att endast plocka fraktioner från ett smalt område runt toppen i kromatogrammet ger vanligtvis en tillräckligt hög lagerkoncentration (>3 000 nM) för många rekonstitueringsapplikationer (som vanligtvis arbetar mellan 10-300 nM). Slutligen, för kvalitetskontroll av septinkomplexens funktionalitet genom fluorescensmikroskopi, är det viktigt att korrekt passivera ytan på mikroskopiglasen, eftersom septinkomplex håller fast vid glas. Passivering av glasskivorna kan göras antingen via PLL-PEG-funktionalisering eller genom bildandet av neutrala (100% DOPC) stödda lipid-dubbelskikt^11,32.

Jämfört med det ursprungliga reningsprotokollet som först beskrevs i Iv et ^al.10 sker en förändring i buffertkompositionerna (tabell 2). Koncentrationen av MgCl2 har sänkts från 5 mM till 2 mM, och koncentrationen och pH för Tris-HCl_har sänkts från 50 mM till 20 mM respektive från 8,0 till 7,4. Dessa förändringar gjordes för att göra buffertförhållandena kompatibla med studier av interaktioner mellan humana septiner och lipid-dubbelskikt, aktinfilament och mikrotubuli^10,11,32. Detta beror på att författarna bildade stödda lipid-dubbelskikt och polymeriserat aktin i F-bufferten, vars sammansättning är identisk med darkSPB, förutom närvaron av ATP i F-bufferten. Buffertförändringen gav inga förändringar i kvaliteten eller livslängden på de renade septinerna jämfört med de ursprungliga buffertarna.

Denna reningsmetod har fortfarande flera begränsningar. För det första kan olika reningsförsök variera i utbyte (0,5-1 ml 2-5 μM septinkomplex) och funktionell kvalitet, vilket kontrolleras av buntbildningsförmågan hos de renade septinkomplexen. Det är därför det är mycket viktigt att konsekvent utföra de kvalitetskontroller som beskrivs i detta dokument. Att kontrollera mycket bra uttryckstiderna och den optiska densiteten hos bakteriekulturen kan hjälpa till att mildra skillnaden i utbyte. För det andra kan denna reningsledning inte skilja mellan trimers och hexamerer eller mellan tetramerer och oktamerer (figur 1B). Kvalitetskontrollexperimenten kan emellertid användas för att bevisa att majoriteten av septinkomplexen är i sin långa oligomerform. Om en ännu smalare oligomerstorleksfördelning krävs kan storleksuteslutningskromatografi infogas mellan steg 1.6. och steg 1.7. av reningsprotokollet. Detta valfria steg minskar dock dramatiskt avkastningen, och det rekommenderas inte om det inte är absolut nödvändigt. En sista, mer grundläggande, begränsning kommer från användningen av E. coli som ett uttryckssystem för rekombinanta septinkomplex. Naturligtvis tillåter detta system inte post-translationella modifieringar (PTM), som har rapporterats i djurceller, såsom fosforylering, acetylering och sumoylering 6,51,52,53. Dessa posttranslationella modifieringar kan läggas till genom att implementera en liknande reningsstrategi i insekts- eller mänskliga celler. Dessutom har detta dokument bara diskuterat rekonstitueringen av septiner i sig, men studier i celler indikerar att regulatoriska proteiner som proteiner från Borg-familjen 54,55 och anillin ^24,25,56 kan ha betydande men dåligt förstådda effekter på septinernas sammansättning och funktioner och därför är viktiga att så småningom införliva in vitro studier. Protokoll för rening av Borgproteiner och anillin har rapporterats^54,57.

Septinreningsprotokollet som rapporteras här erbjuder ett standardiserat sätt att rena septiner i deras oligomerform med rätt subenhet stökiometri, vilket ger ett viktigt framsteg jämfört med många tidigare in vitro-studier som förlitar sig på enstaka septinunderenheter. Även om vissa septiner i specifika sammanhang kan fungera som en enda underenhet², tyder den nuvarande litteraturen starkt på att septiner i djurceller mestadels fungerar i komplex ^9,58. Därför är användningen av förformade hetero-oligomerer, såsom de som beskrivs i detta dokument och andra 10,11,18,32,35,36,37^, av stor betydelse för att studera de strukturella och biofysiska egenskaperna hos septiner via in vitro rekonstitution för att dissekera deras funktioner i cellen. Dessutom är septiner självmonterande proteiner med många interaktionspartners, inklusive membranet och cytoskelettet, vilket gör dem av stort intresse för bottom-up syntetisk biologi 59,60,61 och studier av proteininducerade förändringar i membranbiofysiska egenskaper såsom krökning ^42,62,63.

Materials

488nm laser combiner iLAS2	Gataca		TIRF microscope
488nm Sapphire laser lines	Coherent		Confocal microscope
4k X 4k F416 CMOS camera	TVIPS		For JEM-1400plus
4x sample buffer nativePAGE	Thermo Fisher scientific	BN2003
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813	To prevent blinking
AKTA pure 25 M1	GE healthcare	1680311
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518-25G
Carbon Type-B, 300 mesh EM grid	Ted pella	01813-F
Carbon Type-B, 300 mesh EM grid	Electron micoscopy sciences	CF300-Cu
Cover glass #1.5H	Thorslabs	CG15KH
CSU-X1-M1 confocal unit	Yokogawa		Confocal microscope
Desthiobiotin	Sigma-Aldrich	D1411-1G
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D9779
DNAse	Sigma-Aldrich	10104159001
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
Eclipse Ti2-E	Nikon instruments		Confocal microscope
EDTA-free protease inhibtor cocktail	Roche	481761
HisTrap HP, 5 mL	GE healthcare	29-0588-3
iLAS2 azimuthal TIRF illumination system	Gataca		TIRF microscope
Imidazole	Sigma-Aldrich	1202-1KG
InstantBlue Protein Gel Stain	Westburg Life Sciences	EP ab119211
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher scientific	10849040
iXon Ultra 888 EMCCD camera	Andor		Confocal microscope
iXon Ultra 897 EM-CCD	Andor		TIRF microscope
JEM-1400plus	JOEL		TEM microscope TUDelft
kappa-cassein	Sigma-Aldrich	C0406
LB broth	Sigma-Aldrich	L3022-6X1KG
Lyzozyme	Sigma-Aldrich	62971-10G-F
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	746452-1KG
Methylecllulose	Sigma-Aldrich	8074844
MilliQ system (Integral 10)	Merck-Millipore		I-water dispenser
Mini protean TGX gels	BIORAD	4561086
NativeMark unstained protein standard	Invitrogen	LC0725	For iSCAT and Native gels
NativePAGE 4-16% GELS	Thermo Fisher scientific	BN1002BOX
NativePAGE Running Buffer kit	Thermo Fisher scientific	BN2007
Nikon Ti2-E	Nikon instruments		TIRF microscope
Nr. 1 Menzel coverslips	Thermo Fisher scientific	11961988
parafilm	Sigma-Aldrich	P7668
Plan Apo ×100/1.45 NA oil immersion objective	Nikon instruments		Confocal microscope
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)	SuSoS	CHF560.00
Poly-L-lysine solution 0.01%	Sigma-Aldrich	P4832	For iSCAT glass slides
Pottassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
Power supply for native gels	CONSORT	S/N 71638
POWERPAC UNIVERSAL	BIORAD	042BR31206
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oxygen scavenger – enzyme
Protocatechuic acid (PCA)	Sigma-Aldrich	03930590-50MG	oxygen scavenger – reagent
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110
Quemesa camera	Olympus		For Tecnai Spirit
Refeyn OneMP	Refeyn
Sample buffer, laemmli 2x concentrate	Sigma-Aldrich	S3401-10vl
Silicon gaskets	Sigma-Aldrich	GBL103250-10EA
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes 30k MWCO 3mL	Thermo Fisher scientific	66381
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	PHR1441-1G
StrepTrap HP, 1 mL	GE healthcare	28-9075-46
Tecnai Spirit microscope	Thermo Scientific, FEI		TEM microscope Institute Curie
Terrific broth	Sigma-Aldrich	T0918-1KG
Tris/Glyine/SDS buffer	BIORAD	1610772
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941-1KG
Ultrasonic cleaner	Branson	CPX2800H-E
Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES	Sartorius	VS0622