Summary
O eletrocardiograma (ECG) é a variável chave para o entendimento da eletrofisiologia cardíaca. O exercício físico tem efeitos benéficos, mas também pode ser prejudicial no contexto de doenças cardiovasculares. Este manuscrito fornece um método de registro de ECG em tempo real durante o exercício, que pode servir para investigar seus efeitos na eletrofisiologia cardíaca em camundongos.
Abstract
O exercício físico regular é um dos principais contribuintes para a saúde cardiovascular, influenciando vários processos metabólicos e eletrofisiológicos. No entanto, em certas doenças cardíacas, como síndromes de arritmia hereditária, por exemplo, cardiomiopatia arritmogênica (MAC) ou miocardite, o exercício físico pode ter efeitos negativos sobre o coração, levando a uma produção de substrato proarritmogênico. Atualmente, os mecanismos moleculares subjacentes da remodelação proarritmogênica relacionada ao exercício são amplamente desconhecidos, portanto, ainda não está claro qual frequência, duração e intensidade do exercício podem ser consideradas seguras no contexto da(s) doença(s).
O método proposto permite estudar os efeitos pró-arrítmicos/antiarrítmicos do exercício físico combinando treinamento em esteira com monitorização em tempo real do ECG. Dispositivos de telemetria implantáveis são usados para registrar continuamente o ECG de camundongos em movimento livre durante um período de até 3 meses, tanto em repouso quanto durante o treinamento em esteira. O software de aquisição de dados com seus módulos de análise é utilizado para analisar parâmetros básicos do ECG, como frequência cardíaca, duração da onda P, intervalo PR, intervalo QRS ou duração do QT em repouso, durante e após o treinamento. Além disso, parâmetros de variabilidade da frequência cardíaca (VFC) e ocorrência de arritmias são avaliados. Em resumo, este artigo descreve uma abordagem passo a passo para explorar experimentalmente os efeitos induzidos pelo exercício na eletrofisiologia cardíaca, incluindo potencial remodelamento pró-arritmogênico em modelos murinos.
Introduction
A atividade física regular é importante para uma vida saudável. Certas condições cardiovasculares, no entanto, levam a situações em que essa concordância de senso comum é, no mínimo, questionável. Em pacientes com miocardite, dados atuais mostram até mesmo efeitos adversos do exercício e, portanto, recomenda-se pausar todo o exercício por um determinado período nesses pacientes 1,2,3. Em outras doenças cardiovasculares (DCV), como as síndromes de arritmias hereditárias, comparativamente existem menos evidências sobre o nível adequado de exercício 4,5,6,7, tornando o aconselhamento clínico nesses casos, principalmente para pacientes jovens e fisicamente ativos, muito desafiador.
Remodelamento adverso levando à redução da contratilidade e insuficiência cardíaca e remodelamento proarritmogênico levando a arritmias e morte súbita cardíaca têm sido sugeridos como características dos efeitos deletérios associados ao exercício sobre o coração8. Um grande número de estudos indica efeitos benéficos do exercício moderado sobre um amplo espectro de diferentes doenças 9,10. O treinamento extensivo, no entanto, pode ter efeitos prejudiciais sobre o coração, levando a arritmias, especialmente em atletas saudáveis11. Embora processos de remodelamento estrutural que levem a uma produção vulnerável de substrato pró-arrítmico possam estar subjacentes a essa situação paradoxal, como demonstrado em corredores de maratona12, os mecanismos específicos de remodelamento adverso relacionado ao exercício, tanto em pessoas saudáveis quanto em pacientes com doenças cardiovasculares, permanecem em grande parte desconhecidos.
Em animais, especialmente em camundongos, vários modelos adequados foram desenvolvidos para mimetizar uma ampla gama de doenças cardiovasculares13,14. Além disso, vários modelos de exercícios e protocolos de treinamento foram estabelecidos em camundongos 15,16,17, incluindo treinamento motorizado em esteira, corrida voluntária em roda (VWR) e natação17,18. A avaliação da eletrofisiologia cardíaca pela monitorização eletrocardiográfica depende classicamente de uma conexão condutora direta entre o animal e algum tipo de dispositivo de detecção. Assim, ou os animais precisam ser anestesiados, por exemplo, para obter registros de ECG usando eletrodos afiados19, ou os animais precisam ser imobilizados por um contentor20, ou a qualidade dos dados é reduzida devido a artefatos de movimento, por exemplo, quando se usa eletrodos de pata 21 ou plataformas condutoras22 permitindo apenas análises básicas. Assim, nenhuma das abordagens acima citadas é compatível com protocolos de treinamento e, consequentemente, impede estudos sobre mecanismos relacionados ao exercício que levam a remodelação adversa em camundongos. Os dispositivos de telemetria implantáveis podem superar esses obstáculos e são atualmente a ferramenta mais poderosa e o padrão-ouro para avaliar a eletrofisiologia murina in vivo em animais conscientes e em movimento23,24. As soluções atuais de hardware de telemetria foram desenvolvidas para monitorar camundongos em suas gaiolas25,26 e comumente exigem que um receptor seja colocado sob a gaiola para aquisição de dados, tornando o monitoramento em tempo real fora dessas circunstâncias desafiador. Aqui apresentamos uma abordagem para investigar os efeitos do exercício na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênese por meio do registro de ECG em tempo real durante o treinamento em esteira rolante em camundongos usando dispositivos de telemetria implantados. Todos os parâmetros obtidos foram analisados conforme descrito anteriormente por Tomsits et al.23.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com Animais da Universidade de Munique e todos os procedimentos foram aprovados pelo Governo da Baviera, Munique, Alemanha (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-200). Quatro camundongos C57BL/6N machos selvagens foram utilizados neste estudo.
1. Preparo e implantação cirúrgica do transmissor
NOTA: Para um protocolo detalhado de preparação e implantação do transmissor consulte McCauley et al.26.
- Preparação do transmissor
- Use novos transmissores diretamente, pois estes são estéreis. Se os transmissores forem reutilizados, limpe o dispositivo colocando-o em soro fisiológico para se livrar das manchas de sangue, remova quaisquer fragmentos de tecido aderidos ao transmissor e aos eletrodos de chumbo. Após a limpeza inicial, se necessário, submerja o transmissor em uma solução de limpeza a 1% (consulte a Tabela de Materiais) por 4 h para limpar ainda mais o transmissor.
- Ative o transmissor colocando o ímã fornecido em proximidade. Após a ativação, teste o sinal do transmissor usando um dispositivo de rádio na frequência AM de 530 Hz. Um sinal sonoro nítido e claro indica que o transmissor está ativado, enquanto um transmissor inativado não dá nenhum sinal.
- Preparo cirúrgico e implantação
NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados em condições limpas e estéreis.- Desinfete todas as superfícies e equipamentos reutilizáveis antes de usar e use descartáveis estéreis, por exemplo, gazes, luvas, etc.
- Prepare os eletrodos do transmissor encurtando para comprimentos ideais, o negativo (branco) leva a aproximadamente 3,5 cm e o positivo (vermelho) leva a 2,5 cm. Remova a bainha de isolamento vermelha e branca na ponta dos eletrodos fazendo um pequeno corte para expor 5-7 mm do fio condutor.
NOTA: Esses comprimentos são sugeridos para camundongos BALB/c ou C57BL/6 de 9 a 12 semanas de idade, pesando ~25 g. Ajustar se os animais utilizados no estudo são maiores/mais pesados. - Observe o peso do transmissor e o peso corporal do mouse. Observe também o número de série e os valores de calibração do transmissor fornecidos pela DSI.
OBS: O peso corporal do animal é utilizado para calcular doses de anestésicos e analgésicos. O peso corporal inicial também é utilizado como referência para avaliar a recuperação dos animais no pós-operatório. - Anestesiar o camundongo em uma câmara de indução conectada a um vaporizador de isoflurano lavado com isoflurano a 2%-3% (vol/vol) acionado por 1 L/min de oxigênio a 100%. Aguarde o início completo da narcose e verifique o reflexo da pilha dos pés e da tampa para garantir a profundidade adequada da narcose antes de prosseguir.
- Em seguida, coloque o animal anestesiado em decúbito dorsal e use pomada (ver Tabela de Materiais) para evitar o ressecamento ocular durante o procedimento. Realizar o procedimento cirúrgico em condições limpas em uma suíte cirúrgica para manter a temperatura corporal do mouse em 37 °C. Insira uma sonda retal como sensor de temperatura.
- Manter a anestesia com aplicação contínua de isoflurano (1,5%-2%). Injetar fentanil (0,50 μg/g) por via intraperitoneal para analgesia. Conecte um adsorvente ao sistema de ventilação para evitar que o excesso de gás escape para a sala de cirurgia (recomendado).
- Insira eletrodos de ECG de agulha em ambos os braços e o eletrodo de aterramento na perna esquerda do mouse para obter uma configuração de ECG de derivação I para monitorar o ECG durante a cirurgia e obter o ECG basal.
- Raspar o abdome e o tórax e desinfetar a área da cirurgia usando clorexidina/álcool (ver Tabela de Materiais). Use uma pinça para apertar a pele e realize uma incisão abdominal ventral de 1,5-2 cm usando tesoura (laparotomia).
- Realizar uma bolsa subcutânea (cerca de 1 mm) no tórax superior direito e inferior esquerdo abaixo do coração para colocação dos eletrodos, como mostra a Figura 1.
- Coloque o corpo transmissor suavemente no peritônio acima do intestino. Insira uma agulha de 14 G por via subcutânea de ambas as bolsas no peito superior direito e inferior esquerdo feito anteriormente para criar um túnel para o posicionamento do eletrodo.
- Guie os eletrodos vermelhos e brancos através da agulha para colocá-los em uma configuração de chumbo II. Posicionar e fixar as pontas dos eletrodos com pontos 6.0, eletrodo positivo (vermelho) no tórax inferior esquerdo e eletrodo negativo (branco) no tórax superior direito.
- Sutura de todas as incisões com suturas 6.0 e aplicação de desinfetante (ver Tabela de Materiais) sobre as feridas. Mova o animal para uma gaiola de recuperação (apenas um animal/gaiola) e coloque-o sob uma fonte de calor para manter a temperatura corporal até a recuperação completa da narcose. Somente após a recuperação total e a capacidade de manter a decúbito esternal, o animal pode ser colocado de volta na companhia, se necessário.
- Fornecer ao animal uma dose suficiente de analgésicos e antibióticos pós-cirurgia. Usar carprofeno (5 μg/g) como analgésico e enrofloxacina (5 μg/g) como antibiótico. Monitore a ferida em intervalos regulares para garantir que não haja inflamação ou ocorrência de deiscência da ferida.
- Após 7-10 dias do período de recuperação pós-cirurgia, o animal está pronto para ser submetido ao treinamento em esteira. Certifique-se de que as feridas estão devidamente cicatrizadas e que o rato está saudável antes de iniciar o treino.
OBS: Após a finalização do período experimental, o uso de transmissores de telemetria não requer um método específico de eutanásia. A escolha do método depende de análises posteriores e seus requisitos específicos para a condição do tecido, bem como das regras e regulamentos locais de cuidados com animais e aprovação do respectivo comitê de ética local.
2. Aquisição de dados
- Pré-arranjos
- Para iniciar a aquisição de dados, coloque a gaiola do animal no receptor do sinal. Conecte o receptor de sinal ao sistema de aquisição de dados composto por uma matriz de troca de dados e uma interface de sinal. Conecte o sistema de aquisição de dados a um computador com o software de aquisição para visualização de dados (consulte os detalhes de configuração na Figura 2A).
- Inicie o software e confirme o nome de usuário e a licença na tela a seguir e clique em Continuar. Clique em Hardware para configurar o transmissor e o dispositivo receptor de sinal. Selecione Editar configuração do Physio Tel/HD (MX2) para abrir uma janela de configuração.
- Selecione Configuração MX2 na exibição de lista da guia Configuração para ver todos os transmissores disponíveis e seus números de série na coluna disponível. Clique e arraste o transmissor implantado da coluna disponível para a coluna selecionada.
Observação : se um transmissor estiver listado na coluna selecionada, ele também é adicionado à configuração MX2 na guia de configuração na extremidade esquerda. - Ícones coloridos ao lado do número de série do transmissor indicam o status. Verifique o status de todos os transmissores: verde com marca de verificação = transmissor está sincronizado e pronto; vermelho com ponto de exclamação = transmissor atualmente não disponível, por exemplo, está configurado atualmente em um experimento em outro sistema; amarelo = transmissor está sincronizando ou não tem nenhum receptor conectado. Verifique se há luz verde indicando a transferência nominal de dados.
- Para configurar o transmissor, selecione o número de série do transmissor adicionado e clique em Criar Novo Implante. Selecione ETA-F10 no menu suspenso do modelo de implante para ver os detalhes do implante.
- Selecione o modelo e o número de série do receptor em um menu à esquerda do(s) receptor(es) associado(s) ao implante. Uma lista de receptores conectados e conectados aparece neste menu com uma caixa de seleção.
- Clique em Procurar Implante ETA para atribuir um receptor de sinal ao transmissor implantado. Abra o menu de tipo de sinal e selecione ECG com uma taxa de amostragem de 1.000 Hz. Insira os valores de calibração no verso da embalagem do implante. Selecione Salvar & Sair.
- Clique em Configuração na barra de menus e selecione Configuração do assunto. Uma caixa de diálogo com detalhes do assunto será exibida. Digite o nome do arquivo desejado, que será salvo na configuração do assunto.
- Selecione o sexo do animal e selecione Mouse no menu suspenso de espécies. Abra o menu suspenso de análise e selecione ECG (módulo). Altere a rotulagem padrão para ECG e as unidades para mV, se desejado. Selecione o Gatilho adjacente ao ECG.
- Clique em ECG sob o nome do assunto no menu à direita para abrir o menu de detalhes do canal. Selecione os parâmetros de ECG desejados, como Num (número do ciclo), FC (frequência cardíaca) ou intervalos como PR-I, QT-I, RR-I, QRS, etc. da lista de parâmetros.
- Para configurar a exibição, clique em Configuração na barra de menus e selecione Configuração de experimento. Uma caixa de diálogo de configuração é exibida. Selecione a Configuração do gráfico no menu da extrema direita para definir até 16 janelas gráficas fornecendo dados brutos, por exemplo, sinais de ECG e parâmetros derivados, por exemplo, loop XY, tendência HR. Para exibir o ECG, marque a caixa de seleção Habilitar Página para a página 1.
- Treinamento em esteira rolante com gravação simultânea de ECG em tempo real
- Prepare um arranjo experimental como mostrado na Figura 2B para uma esteira de 2 pistas com monitoramento de ECG em tempo real durante o treinamento.
NOTA: Recomenda-se uma esteira de roedores de 5 pistas (consulte a Tabela de Materiais) para treinamento. A configuração consiste em uma correia transportadora dividida em cinco compartimentos de funcionamento e uma unidade de controle com tela sensível ao toque. Cada compartimento de corrida é formado por uma caixa de Plexiglas transparente com uma tampa, montada na correia transportadora. Cada compartimento possui uma rede de choque elétrico onde pulsos elétricos curtos atuam como estímulo para manter o animal funcionando. Cada compartimento é conectado individualmente à unidade de controle para permitir o ajuste específico do compartimento da intensidade do choque. A unidade de controle pode exibir a distância percorrida, o número de choques e a duração total dos choques. Como todos os compartimentos compartilham a mesma correia transportadora, a velocidade e a inclinação só podem ser ajustadas para todos os compartimentos ao mesmo tempo. - Para permitir uma boa transdução do sinal durante o treinamento, coloque o receptor de sinal em cima da caixa que estabelece a pista de corrida com o animal como mostra a Figura 2B. A posição exata do receptor de sinal na pista de rolamento difere entre animais individuais devido a diferentes relações sinal/ruído.
- Mova o receptor de sinal até encontrar a posição ideal na faixa de rodagem. Faça isso executando um experimento de teste com um animal em treinamento e observe a posição com melhor relação sinal/ruído. Use essa posição ideal para o experimento real.
NOTA: Devido ao tamanho do receptor de sinal e posicionamento do receptor normal ao eixo das pistas de rolamento (como mostrado na Figura 2B), apenas dois animais podem treinar ao mesmo tempo com monitoramento de ECG nesta configuração.
- Mova o receptor de sinal até encontrar a posição ideal na faixa de rodagem. Faça isso executando um experimento de teste com um animal em treinamento e observe a posição com melhor relação sinal/ruído. Use essa posição ideal para o experimento real.
- Divida o treinamento em esteira nas duas fases seguintes.
- Fase de aclimatação: tempo em que o animal está adaptado às condições de treinamento. Realizar um protocolo de aclimatização de 1 semana, conforme mostrado na Tabela 1 , com a velocidade de corrida e o tempo de treinamento para cada dia, conforme descrito.
- Fase de treinamento: Pós-aclimatação, treine o animal em velocidade fixa por um tempo fixo por dia, totalizando X dias. Para esse protocolo, realizar um regime de treinamento de 5 dias ao longo de 3 semanas com velocidade constante de 25 cm/s e duração de 60 min/dia (Tabela 2). Após 5 dias de treinamento, providencie uma pausa de 2 dias antes da próxima semana de treinamento.
NOTA: X define o número total de dias de treinamento e é definido com base no objetivo experimental.
- Ligue a esteira. Defina a inclinação, a velocidade e a intensidade do choque da esteira de acordo com o protocolo de treinamento. Use uma inclinação ascendente de 5°, o que leva a um nível moderado de estresse (recomendado). Use a mesma inclinação para a fase de aclimatação e fase de treinamento.
OBS: A inclinação da esteira define a intensidade do treinamento; Escolha a inclinação desejada. O protocolo de treinamento pode variar de acordo com o objetivo experimental. - Pressione em Configurações na unidade de controle e selecione Teste de grade. Isso abre uma tela de seleção de tamanho de grade. Selecione Ratos. Uma tela de teste de grade aparecerá com dois subtestes: teste de choque e teste de limpeza. Pressione em Iniciar para iniciar o teste de choque. Uma mensagem avisando o usuário sobre choques de teste será exibida. Para iniciar o teste, confirme o aviso tocando na tela.
- Coloque a parte condutora do acessório de esponja fornecido com a esteira na grade da esteira. Coloque-o até que a palavra Pass apareça na tela. Teste todas as grades assim. O teste terminará automaticamente depois que todas as pistas passarem com sucesso, mas pode ser interrompido a qualquer momento pelo usuário pressionando o botão Parar .
- Para continuar com o teste de limpeza, pressione o botão >> e Iniciar e aguarde a execução do teste. Este teste também será interrompido automaticamente assim que todas as faixas passarem por ele. Se o teste falhar, uma mensagem de aviso aparecerá na tela. Toque na mensagem para ver o resultado.
NOTA: Estes testes são feitos para verificar a limpeza e a função da grelha. As redes devem estar limpas para garantir uma boa detecção dos animais e, posteriormente, a entrega correta do estímulo elétrico, se necessário. Se o teste falhar, limpe as grades, verifique se todos os cabos estão conectados corretamente e repita o teste. - Transfira o animal para o compartimento de corrida. Coloque o receptor de sinal na caixa transparente e conecte o receptor de sinal através do cabo de conexão ao sistema de aquisição de dados, que consiste em uma matriz de troca de dados e uma interface de sinal, que por sua vez se conecta a um computador com o software de aquisição em execução para visualizar o sinal de ECG durante o experimento.
- Pressione Iniciar para entrar no modo de execução. Os animais receberão um pequeno impulso elétrico quando em contato com a rede elétrica, que encaminhará o animal em direção à pista de rolamento. Use intensidade de choque mínima de 0,1 mA. Isso é suficiente para motivar os animais, mas não é visível no registro do ECG. Tente colocar pelotas de comida fora das linhas de corrida dentro da visão do animal para mantê-lo motivado.
NOTA: A gama dada pelo fabricante para choques eléctricos é de 0,1 mA-2 mA. O aumento da intensidade do choque pode ser necessário em diferentes linhagens de camundongos ou sob diferentes condições experimentais, no entanto, recomendamos o uso da menor intensidade de choque possível. Alternativamente, para reduzir os choques elétricos gerais, tente manter o animal na pista de rolamento empurrando-o suavemente, por exemplo, com fones de ouvido de algodão ou estimulando-o com uma suave baforada de ar comprimido. Se os animais forem bem treinados, a rede elétrica e a pista de rolamento podem ser separadas por um pedaço de isopor para evitar choques indesejados. - Se um animal não treinar e não puder ser motivado mesmo com choque elétrico, retire-o do protocolo de treinamento para aquele dia se não houver melhora nos primeiros 15 min do experimento.
- Após a conclusão, deixe o animal descansar por 5 min após o treinamento antes de transferi-lo de volta para a gaiola. Remova o receptor de sinal da caixa transparente e coloque-o novamente embaixo da gaiola, como mostra a Figura 2A. Desligue a esteira para evitar choques indesejados.
- Limpe a esteira, os compartimentos de corrida e a rede elétrica com agente de limpeza sem álcool. Pistas limpas levam a melhores resultados de treinamento.
OBS: Durante o treinamento, é importante a limpeza constante das pistas, pois os animais param de correr em pistas sujas. Usamos fones de ouvido de algodão para nos livrarmos das fezes dos animais durante o treinamento.
- Prepare um arranjo experimental como mostrado na Figura 2B para uma esteira de 2 pistas com monitoramento de ECG em tempo real durante o treinamento.
3. Análise dos dados
NOTA: Dependendo dos objetivos individuais da pesquisa, vários parâmetros podem ser obtidos e analisados. Esse protocolo enfoca dois aspectos: análise das características quantitativas do ECG e da ocorrência de arritmias antes, durante e após o treinamento utilizando uma abordagem previamente descrita por Tomsits etal.23; e análise da variabilidade da frequência cardíaca (VFC)27.
- Análise de ECG
- Para uma descrição detalhada, consulte Tomsits et al.23. Em resumo, inicie o software, confirme o nome de usuário e o número de série da licença de software e clique em Continuar.
- Para abrir um arquivo com a extensão. PnmExp, clique em Load Experiment. A caixa de diálogo Procurar pasta é aberta, selecione o arquivo e clique em Abrir.
- Vá para Ações/ Iniciar revisão na barra de ferramentas e selecione a caixa de diálogo Carregar dados de revisão , que fornece uma visão geral de todos os assuntos e seus sinais gravados dentro do experimento selecionado anteriormente.
- Selecione o arquivo a ser analisado clicando na caixa de seleção ao lado de seu nome no painel Assuntos no lado esquerdo da tela. Para analisar o ECG, marque a caixa de seleção ao lado de ECG no painel de tipos de sinal.
- Selecione toda a gravação ou defina um intervalo ou duração usando a opção de intervalo de tempo. Clique em OK para carregar o conjunto de dados selecionado na revisão e as janelas para eventos e parâmetros abrirem automaticamente.
- Para exibir o ECG, clique em Configuração do gráfico na barra de ferramentas do menu para abrir uma nova janela. Selecione Primário no tipo de sinal, digite Hora 0:00:00:01 e selecione os limites desejados de Rotulagem, Unidade de exibição e Eixo Baixo e Alto inserindo as respectivas caixas de texto. Confirme clicando na caixa de seleção Ativar Página e a janela de rastreamento de ECG definida será exibida.
- Ajuste as dimensões dos eixos X e Y do ECG clicando duas vezes. Clique com o botão esquerdo do mouse no rastreamento para mostrar a anotação de onda e reconhecer e anotar cada segmento do rastreamento, onda P, Q, R, T, corretamente.
NOTA: Se as anotações não estiverem corretas, várias opções, QRS, PT, Avançado, Ruído, Marcas, Notas, Precisão, podem ser usadas para otimizar, por exemplo, a opção Analisar/ Atributos usando o botão direito do mouse. Para uma descrição detalhada, consulte Tomsits et al.23. - Selecione os parâmetros de ECG necessários na janela de parâmetros e copie para uma planilha ou um software de estatística para análise adicional.
- Detecção de arritmias
- Para detecção de arritmia, clique em Experimento/Data Insights para abrir uma nova janela de insight de dados.
- Defina regras de pesquisa personalizadas para exibir a gravação no painel de pesquisa. Crie uma nova pesquisa selecionando Criar nova pesquisa após um clique com o botão direito do mouse na lista de pesquisa.
- No menu suspenso da caixa de diálogo de entrada, defina a respectiva regra de pesquisa e clique em OK para adicionar essa regra de pesquisa à lista. Para aplicar regras de pesquisa, clique nelas e arraste-as para o canal de interesse à esquerda.
- No painel de resultados, cada seção dentro da gravação de ECG à qual a regra se aplica é exibida. Para uma visão detalhada sobre as diferentes regras de pesquisa, consulte Tomsits et al.23. Para duas regras exemplares, bradicardia e taquicardia, veja a definição e descrição abaixo.
NOTA: Para essas regras de busca, a frequência cardíaca fisiológica murina é definida de acordo com Kaese et al.28 como 500-724 batimentos/min, correspondendo a uma duração do ciclo de 82-110 ms.- Bradicardia: Em uma abordagem em duas etapas, identifique cada intervalo RR individual maior que 120 ms. Como a bradicardia requer mais de um único intervalo RR alongado, defina uma regra de busca adicional para identificar apenas 20 intervalos RR consecutivos maiores que 120 ms como bradicardia da seguinte forma: Bradicardia-simples como Valor (FCcica0) <500 e Bradicardia como Série (Bradicardia-única, 1) >=20. Clique em OK para adicionar esta regra de pesquisa à lista.
- Seguindo a mesma abordagem para taquicardia, defina Taquicardia-simples como Valor (FCcyc0) >724, identificando cada intervalo RR individual menor que 82 ms, e então adicione a regra de busca adicional Taquicardia como Série (Taquicardia-única, 1) >=20. Clique em OK para adicionar esta regra de pesquisa à lista.
- Análise da variabilidade da frequência cardíaca
NOTA: A análise da variabilidade da frequência cardíaca (VFC) não é feita no software de aquisição e requer a exportação de dados do software de aquisição em um formato legível. Aqui, fornecemos um pequeno guia passo a passo para a exportação de dados no formato de dados europeu (EDF) amplamente utilizado.- Inicie o software, confirme o nome de usuário e o número de série e clique em Continuar.
- Para exportar o rastreamento de ECG para, por exemplo, análise de VFC, clique em Experimento e selecione Exportar para EDF. Na janela Exportar para EDF, selecione o número do animal, verifique ECG, selecione um intervalo de tempo para o qual os dados serão exportados e clique em Exportar.
NOTA: Não há limite para o intervalo de tempo exportado definido pelo software, mais dados levarão mais tempo para serem processados. Também é possível dividir as exportações em seções, por exemplo, 24 h e reintegrá-las em um momento posterior, se necessário. - Inicie o software de análise usado para análise de VFC (consulte Tabela de Materiais), clique em Arquivo e selecione Abrir para carregar o arquivo EDF desejado.
- Clique em HRV e selecione Configurações. Isso abrirá uma janela para definir vários parâmetros. Em detecção de batimento, selecione a espécie para a qual a análise de VFC é feita. A seleção das espécies definirá os valores de largura do compartimento do histograma, limiar de pRR e valor médio de SDARR dentro do painel de análise para um padrão predefinido.
- Selecione HRV e escolha Exibição de relatório. Copie os resultados para um software de estatística para análise estatística adicional.
- A qualidade do sinal pode ser significativamente menor durante as fases de treinamento. Em caso afirmativo, selecione manualmente os ciclos com P e QRS visíveis para análise subsequente. Exclua marcas de dados incorretas e marcas de dados sem ondas P claras da análise. Faça isso sob a consideração cuidadosa de um analista de ECG experiente para evitar a eliminação de bons pontos de dados.
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Representative Results
Dependendo dos objetivos individuais da pesquisa, a análise subsequente dos dados de telemetria obtidos será amplamente diferente. Aqui, demonstramos a viabilidade do método obtendo dados de boa qualidade registrados durante os períodos de treinamento e fornecemos resultados exemplares de ECGs e análises de variabilidade da frequência cardíaca antes, durante e após o treinamento. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM), todas as análises estatísticas foram realizadas com um software estatístico adequado (ver Tabela de Materiais). A significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student. O intervalo QT é corrigido conforme discutido anteriormente por Roussel e col. usando a fórmula QTc = QT / (√(RR / 100))29.
Gravação telemétrica de ECG bem-sucedida durante o treinamento
Com esse protocolo, é possível obter dados de ECG com ondas P, Q, R, S e T nítidas nos animais durante o treinamento, como demonstrado na Figura 3.
Todas as medidas de um animal foram realizadas no mesmo dia. As medidas basais foram realizadas às 10 horas ± 10 minutos antes do treinamento, quando os animais ainda estavam em seu alojamento permanente. As medidas durante o treinamento foram tomadas a partir do meio da sessão de treinamento de 60 min ± 10 min no dia 3 na terceira semana de treinamento, as medidas pós-treinamento foram tomadas a partir do período de repouso de 5 min após o treinamento e antes da retransferência para o alojamento permanente e as medidas recuperadas foram tomadas 1 h após o treinamento ± 10 min. Seções adequadas do traçado de ECG para análise foram escolhidas manualmente a partir dessas seções definidas em relação à leitura, por exemplo, 40 ciclos consecutivos para os dados apresentados na Figura 4.
Avaliação de parâmetros derivados do ECG
Os dados são utilizados para analisar as alterações fisiológicas antes, durante e após o exercício, como mostrado para um animal de exemplo na Figura 4. A frequência cardíaca (Figura 4A), o intervalo PR (Figura 4B), a duração do QRS (Figura 4C) e o intervalo QTc (Figura 4D) são avaliados pela média de 40 ciclos consecutivos de ECG. A frequência cardíaca aumenta para cerca de 800 bpm quando o animal está se exercitando e gradualmente se recupera em direção à linha de base após o treinamento. O intervalo PR, a duração do QRS e os intervalos QTc diminuem sob estresse e, uma vez terminado o estresse, retornam à linha de base. Dados exemplares de um animal são mostrados.
Detecção de taquicardia
Foram utilizadas as definições de busca descritas na etapa 3.2.4 para detecção de episódios de taquicardia e bradicardia. A Figura 5A mostra o ritmo sinusal basal. Um traço representativo de taquicardia sinusal durante o treinamento é mostrado na Figura 5B. Dados exemplares de um animal são mostrados aqui.
Avaliação da qualidade dos dados por meio da avaliação de parâmetros de variabilidade da frequência cardíaca
A análise da VFC é feita conforme descrito na etapa 3.3. Cortes de 5 min para análise da VFC são apresentados na Figura 6. A Figura 6A mostra a frequência cardíaca de um único animal ao longo de um experimento. A frequência cardíaca aumenta durante o treinamento e retorna gradualmente aos valores basais após o treinamento, essa tendência também pode ser visualizada pelo intervalo RR mediano como mostrado na Figura 6B. A Figura 6C mostra desvio padrão comparável dos intervalos RR (DRSD) obtidos no início e durante o treinamento por anotação automática de RR, demonstrando a qualidade dos dados. Os dados obtidos são de três camundongos. O SDRR é o desvio padrão de todos os intervalos interbatimentos (IBI) e é calculado automaticamente pelo software como raiz quadrada positiva da variância do IBI em torno do IBI médio usando a fórmula:
σx = 
Figura 1: Ilustração esquemática do transmissor de telemetria e posicionamento do eletrodo. O rato está em decúbito dorsal; o transmissor é colocado intraperitonealmente, e os eletrodos são fixados subcutaneamente em uma configuração de derivação II. Criado com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Montagem experimental . (A) Configuração para gravação do ECG por telemetria implantável antes e após o treinamento com o receptor de sinal sendo mantido embaixo da gaiola do animal. (B) Configuração para monitorização de ECG em tempo real durante o treinamento em esteira. Para uma qualidade de sinal ideal, o receptor de sinal é colocado na caixa transparente. Criado com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ECG representativo durante o treinamento. Ritmo sinusal normal, onda P, QRS e onda T são indicados com letras maiúsculas, o intervalo RR é marcado com uma barra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Telemetria ao longo do tempo. Os gráficos de tendência mostram resultados representativos para (A) frequência cardíaca (BPM). (B) Intervalo PR (ms). (C) Duração do QRS (ms). (D) Intervalo QTc (ms) antes (basal), durante (treinamento), imediatamente após o treinamento (pós-treinamento) e após a recuperação completa (recuperado). Os dados são obtidos de um animal por uma média de 40 ciclos consecutivos de ECG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ECG representativos antes e durante o treinamento. (A) Ritmo sinusal antes do treinamento. (B) Taquicardia sinusal durante o treinamento. Os dados são de um animal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Avaliação da qualidade dos dados pela análise da VFC . (A) Tendência representativa da frequência cardíaca de um único animal antes (basal), durante (treinamento) e após (pós-treinamento) exercício. (B) Mediana do intervalo RR antes (basal) e durante o treinamento (treinamento) e após a recuperação completa (recuperado), apresentada como média ± EPM, teste t de Student não pareado, ***p < 0,001. (C) SDRR antes (basal) e durante o treinamento (treinamento) e após a recuperação completa (recuperado), n = 3, apresentado como média ± EPM. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
| Fase de aclimatação de 5 dias | ||
| Dia | Velocidade (cm/seg) | Tempo (min) |
| 1 | 16.7 | 10 |
| 2 | 18.3 | 20 |
| 3 | 20 | 30 |
| 4 | 21.7 | 40 |
| 5 | 23.3 | 50 |
| Observação: intervalos de descanso de 2 min a cada 15 min | ||
Tabela 1: Regime de treinamento durante a fase de aclimatação.
| Fase de treinamento de 5 dias | ||
| Dia | Velocidade (cm/seg) | Tempo (min) |
| 1 | 25.0 | 60 |
| 2 | 25.0 | 60 |
| 3 | 25.0 | 60 |
| 4 | 25.0 | 60 |
| 5 | 25.0 | 60 |
| Observação: intervalos de descanso de 2 min a cada 15 min | ||
Tabela 2: Regime de treinamento durante a fase de treinamento.
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Discussion
As diretrizes atuais recomendam a prática regular de atividade física por ser um importante modificador dos fatores de risco cardiovascular30. Há também um crescente corpo de evidências de que a atividade física moderada pode proteger contra fibrilação atrial (FA) tanto na prevenção primária quanto na secundária31,32,33. Ao contrário, atletas de endurance, como maratonistas, têm maior risco de desenvolver FA, indicando que o treinamento de endurance também pode ter efeitos negativos34,35. Tal relação em forma de U entre risco de arritmia e intensidade de treinamento foi claramente demonstrada para FA em atletassaudáveis9,36,37,38 e em pacientes com doença cardíaca subjacente, no entanto, pouco se sabe sobre intensidade de treinamento e arritmogênese4,5,6,7.
Para superar essa limitação e melhorar o atendimento ao paciente, mais pesquisas sobre os efeitos relacionados ao exercício na eletrofisiologia cardíaca são necessárias. Para investigar mecanismos fundamentais e adaptações moleculares/celulares em resposta ao treinamento diferentes modelos em diversas espécies animais têm sido desenvolvidos15. Dados os benefícios imanentes, mas também as limitações de cada modelo/espécie, os pesquisadores têm que escolher o mais adequado para cada questão de pesquisa individual; Em relação à pesquisa eletrofisiológica e arritmia, camundongos 13,14,39,40 e modelos suínos são amplamenteutilizados13,14,41,42,43. Embora protocolos de treinamento com esteira motorizada tenham sido desenvolvidos em suínos, há uma série de desafios significativos, incluindo (i) o comportamento sedentário dos suínos, que requer um condicionamento intenso de tempo e trabalho antes do experimento, bem como estímulos para manter os porcos aderentes durante o experimento e (ii) o tamanho e o peso corporal, o que pode impedir o treinamento em porcos mais velhos ou o treinamento por longos períodos de tempo15, 44º. Em camundongos, vários protocolos de exercício foram desenvolvidos, incluindo treinamento motorizado em esteira, VWR ou natação17,18. Embora a VWR mimetize o padrão natural de corrida em roedores e seja menos estressante em comparação com métodos de exercícios forçados, como natação e treinamento em esteira, ela também apresenta certas desvantagens45. A natureza espontânea da VWR não permite controlar a intensidade, a duração ou a frequência do exercício, impedindo experimentos bem controlados. Em modelos de natação, a duração e a intensidade do treinamento podem ser facilmente reguladas, os equipamentos necessários são simples e disponíveis a baixo custo, e o método pode ser estabelecido na maioria dos laboratórios de pesquisa46. Apesar dessas vantagens, estudar eletrofisiologia em um modelo de natação é difícil, pois atualmente não há opção de monitorar o ECG durante a natação. A abordagem descrita neste protocolo combina um sistema de telemetria implantável com um modelo de exercício em esteira rolante e, assim, supera as limitações de outros modelos de treinamento no contexto da pesquisa emeletrofisiologia47,48. O uso de uma esteira permite controlar várias condições de exercício, como intensidade (inclinação da inclinação e velocidade de corrida) ou duração. Além disso, diferentes protocolos de treinamento podem ser estudados, incluindo treinamento de exercícios de resistência, treinamento intervalado e exercícios agudos. Seguindo esse protocolo, agora também é possível gravar e monitorar o ECG usando transmissores de telemetria implantáveis enquanto o mouse está rodando na esteira.
Dado que os ratos geralmente correm voluntariamente por apenas alguns minutos, estímulos como bater as costas com pequenos bastões, soprar sopros de ar comprimido ou estímulos elétricos são necessários. Esses estímulos, no entanto, podem induzir estresse psicológico, o que pode afetar significativamente a qualidade dos dados experimentais. Assim, procurou-se minimizar esses fatores de estresse permitindo que o camundongo se adaptasse à esteira durante uma fase de aclimatização, com um incremento constante de velocidade e utilizando intensidade de choque mínima a zero, como descrito anteriormente15,17,45.
Em geral, ao registrar ECGs, os artefatos de movimento são um grande problema, especialmente durante a atividade física. Seguindo nosso protocolo proposto, os pesquisadores poderão adquirir sinais de ECG em boa qualidade, permitindo distinguir e anotar claramente P, Q, R, S, T (Figura 3). Assim, vários parâmetros do ECG, como frequência cardíaca, variabilidade da frequência cardíaca, intervalo PR, duração do QRS ou duração do QT, podem ser avaliados de forma confiável antes, durante e após o treinamento usando algoritmos de software automatizados. Além disso, arritmias como taquiarritmia, bradiarritmia ou pausas podem ser detectadas. Como as análises da variabilidade da frequência cardíaca - usualmente realizadas para investigar os efeitos do sistema nervoso autônomo sobre o coração27,28 - dependem de anotação suficiente da onda R, a qualidade dos dados pode ser verificada por valores igualmente baixos de SDRR obtidos em repouso e durante o treinamento por anotação automatizada, como mostrado na Figura 6.
Como toda técnica experimental, este método não vem sem armadilhas e contém várias etapas críticas. Condições estéreis e um curto tempo de operação são requisitos para a implantação bem-sucedida do transmissor, cicatrização adequada de feridas e rápida recuperação do animal após a cirurgia. As suturas não devem ser muito apertadas, ou causarão necrose da pele. Em geral, o procedimento cirúrgico requer experiência prática, e os resultados melhorarão com o tempo. O posicionamento do eletrodo influencia o vetor principal registrado, os melhores resultados são obtidos com uma inclinação íngreme na posição dois, pois resulta em maiores amplitudes das ondas P e R, que por sua vez são requisitos críticos para análises posteriores do ECG. Treinar ratos pode ser desafiador, pois nem todos os animais treinam voluntariamente. Um protocolo de aclimatização bem desenhado, incluindo introdução ao ambiente da esteira, incrementos lentos na velocidade da correia transportadora e melhora positiva do bom comportamento de treinamento, por exemplo, com pellets de comida, pode ajudar a condicionar os animais a treinar melhor e reduzir a necessidade de estímulos potencialmente interferentes durante os experimentos. É importante reduzir todos os estímulos ao mínimo absoluto, pois eles podem afetar a qualidade dos dados. No entanto, a etapa mais crítica é o posicionamento ideal do receptor de telemetria durante o treinamento em esteira, pois determina diretamente a qualidade dos dados obtidos. A posição do receptor deve ser determinada para cada par de animais em treinamento ao mesmo tempo, pois varia em função da posição exata do dispositivo de telemetria e dos eletrodos, bem como do padrão de corrida individual dos animais. A posição é encontrada por tentativa e erro, julgando visualmente a qualidade do sinal em tempo real. Todas as características do ECG a serem analisadas devem ser claramente visíveis antes que os experimentos possam começar. Dada a alta frequência cardíaca murina, muitos pontos de dados se acumulam mesmo com curtos períodos de gravação. Isso e a baixa amplitude geral do sinal, levando naturalmente a uma menor relação sinal-ruído em roedores do que em humanos ou animais de grande porte, tornam a análise dos dados extremamente desafiadora, como discutimos anteriormente23. Uma grande limitação desse protocolo, além do dispendioso equipamento necessário para a realização de telemetria e treinamento em esteira, é a alta demanda técnica no procedimento cirúrgico e na análise dos dados, limitando a acessibilidade para iniciantes na área.
Em suma, o ECG é uma ferramenta brilhante para estudar a eletrofisiologia cardíaca e a arritmogênese. Em humanos, testes de esforço para registrar ECGs durante o exercício são realizados rotineiramente e permitem avaliar os efeitos associados ao treinamento na eletrofisiologia cardíaca. Os camundongos são as espécies mais utilizadas em pesquisas, vários protocolos de exercícios foram desenvolvidos, mas o monitoramento do ECG em tempo real durante o treinamento não foi possível até o momento. Nosso protocolo proposto permite obter registros de ECG durante períodos de exercício em camundongos pela primeira vez. Isso permitirá que os pesquisadores estudem tanto os mecanismos relacionados ao exercício que levam a adaptações cardíacas benéficas quanto o remodelamento proarrítmico maladaptativo e, assim, eventualmente resultará em melhor atendimento ao paciente no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 to P. Tomsits), o Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss), a Fundação Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss) e a ERA-NET sobre Doenças Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss). Os financiadores não tiveram nenhum papel na preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14-gauge needle | Sterican | 584125 | |
| Any mouse | e.g. Jackson Laboratories | ||
| Bepanthen | Bayer | 1578675 | |
| Carprofen 0.005 mg/µL | Zoetis | 53716-49-7 | |
| Data Exchange Matrix 2.0 (MX2) | Data Science International | Manages communication between PhysioTel and PhysioTel HD telemetry implants and the acquisition computer. | |
| Enrofloxacin 25 mg/ml | Baytril | 400614.00.00 | |
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Five Lane Treadmill for Mouse | Panlab - Harvard Apparatus | 76-0896 | Includes treadmill unit, touchscreen control unit, a sponge , and cables |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-Pharma | 31303 | |
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| LabChart Pro 8.1.16 | ADInstruments | ||
| Magnet | Data Science International | ||
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Modular connectors | Data Science International | Connecting cables between Reciever, Signal Interface and Matrix 2.0 (MX2) | |
| Novafil s 5-0 | Medtrocin/Covidien | 88864555-23 | |
| Octal BioAmp | ADInstruments | FE238-0239 | Amplifier for recording Surface ECG |
| Octenisept | Schülke | 121418 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| PhysioTel ETA-F10 transmitter | Data Science International | ||
| PhysioTel receiver RPC-1 | Data Science International | Signal reciever | |
| Ponemah 6.42 | Data Science International | ECG Analysis Software | |
| Powerlab | ADInstruments | 3516-1277 | Suface ECG Acquisition hardware device. Includes ECG electrode leads |
| Prism 8.0.1 | Graph Pad | ||
| Radio Device (Sony AF/AM) | Sony | ||
| Signal Interface | Data Science International | Acquires and synchronizes digital signals with telemetry data in Ponemah v6.x. | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| Tergazyme 1% | Alconox | 13051.0 | Commercial cleaning solution |
| Tweezers | Kent Scientific | INS600098-2 |
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