Summary
Neste protocolo, a nova cirurgia de revascularização do miocárdio foi realizada através de uma pequena incisão na parede torácica esquerda, sem circulação extracorpórea. Foi realizado um estudo anatomopatológico pós-operatório, que mostrou espessamento intimal.
Abstract
A doença do enxerto venoso (DPV) é a principal causa de insuficiência da revascularização miocárdica (CRM). Grandes modelos animais de CRM-VGD são necessários para a investigação dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
Para realizar a cirurgia, entramos na câmara cardíaca através do terceiro espaço intercostal e dissecamos cuidadosamente a veia mamária interna e a mergulhamos em solução salina normal. A artéria coronária principal direita é então tratada para isquemia. O vaso-alvo é incisado, um tampão de derivação é colocado e a extremidade distal da veia do enxerto é anastomosada. A aorta ascendente é parcialmente bloqueada e a extremidade proximal da veia do enxerto é anastomosada após a perfuração. A veia do enxerto é verificada quanto à perviedade e a artéria coronária direita proximal é ligada.
A cirurgia de revascularização miocárdica é realizada em minipigas para colher a veia mamária interna esquerda para seu uso como enxerto vascular. Testes bioquímicos séricos são utilizados para avaliar o estado fisiológico dos animais após a cirurgia. O exame ultrassonográfico mostra que a extremidade proximal, média e distal do vaso do enxerto está desobstruída. No modelo cirúrgico, observa-se fluxo sanguíneo turbulento no enxerto ao exame histológico após a cirurgia de revascularização miocárdica, e estenose do enxerto venoso associada à hiperplasia intimal no enxerto. O estudo aqui fornece procedimentos cirúrgicos detalhados para o estabelecimento de um modelo de DVG induzida por CRM repetível.
Introduction
Embora a mortalidade por doença coronariana tenha diminuído significativamente nos últimos anos, metade dos adultos de meia-idade nos Estados Unidos desenvolve sintomas isquêmicos relacionados ao coração a cada ano, e um terço dos idosos morre de doença coronariana1. A revascularização miocárdica (CRM) é uma modalidade cirúrgica eficaz para melhorar a isquemia miocárdica e, mais importante, é uma modalidade cirúrgica insubstituível para o tratamento da doença arterial coronariana multiarterial2. Com o tempo, no entanto, os enxertos vasculares desenvolvem inflamação, hiperplasia intimal e aterosclerose progressiva, que é conhecida por levar à falência do enxerto venoso ou doença do enxerto venoso (VGD)3. Em pacientes após revascularização miocárdica, se ocorrer reestenose, apenas o vaso sanguíneo doente pode ser substituído em alguns casos2. Pacientes mais velhos e comorbidades adicionais tornam o refazer a revascularização do miocárdio bastante desafiador. Atrasar ou controlar os problemas patológicos associados aos vasos sanguíneos enxertados é um problema urgente a ser resolvido. Grandes modelos animais de CRM-VGD são necessários para a investigação dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. Pesquisadores estabeleceram com sucesso modelos animais de VGD em animais pequenos e grandes, como camundongos4, ratos5, coelhos6 e porcos7. Em comparação com os pequenos animais, os animais de grande porte, como os suínos, apresentam estruturas anatômicas e características fisiológicas semelhantes aos humanos e maior expectativa de vida 8,9. Assim, animais de grande porte são mais adequados para explorar alterações patológicas de longo prazo na doença do enxerto venoso e para testes pré-clínicos de medicamentos ou dispositivos. Nós e nossa equipe colaboradora aplicamos com sucesso técnicas cirúrgicas para estabelecer um modelo de insuficiência cardíaca suína e descrevemos as alterações patológicas cardíacas nesse modelo10.
A cirurgia de revascularização miocárdica tem sido padronizada na prática clínica, mas quando aplicada ao estabelecimento de modelos animais VGD, as diferenças entre espécies, a aquisição de equipamentos e instalações animais, operações cirúrgicas em animais e alimentação e enfermagem animal são enormes desafios para os pesquisadores. Assim como na prática clínica, as abordagens para a cirurgia de revascularização miocárdica utilizadas para estabelecer modelos animais de DVG incluem esternotomia de linha média11 e toracotomia lateral esquerda12. A esternotomia da linha média é mais comumente utilizada13,14. No entanto, essa abordagem tem altos riscos para humanos e animais. No estudo relatado por Thankam et al., dois dos seis porcos utilizados para modelagem morreram durante a cirurgia15. A alta mortalidade do modelo aumenta os custos do estudo e afeta a precisão dos resultados. Um estudo mostrou anteriormente que uma incisão na parede torácica esquerda era viável para estabelecer a DVG induzida por CRM em suínos11. Aqui, este estudo tem como objetivo descrever um protocolo passo-a-passo para estabelecer uma cirurgia reprodutível para um modelo de DVG induzida por CRM em minipigs e avaliar o fenótipo desse modelo. O protocolo experimental foi elaborado em conjunto pelas equipes de cirurgia cardíaca e anestesia. A abordagem cirúrgica para o terceiro espaço intercostal esquerdo foi determinada de acordo com os cadáveres de outros minipigs no laboratório antes da cirurgia, e o método anestésico foi realizado de acordo com o método utilizado no centro16. Exames bioquímicos sanguíneos, exames ultrassônicos e histológicos foram realizados para avaliar modelos animais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os procedimentos para o cuidado e uso de animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Monitoramento de Animais de Laboratório de Guangdong. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Ed., 2011, National Research Council, EUA). O procedimento cirúrgico é apresentado na Figura 1.
1. Preparação pré-operatória dos animais
- Divida aleatoriamente 10 miniporcos machos de 3 meses de idade, pesando 30-35 kg, no grupo simulado (n = 5) e no grupo VGD (n = 5).
- Avaliar as condições de saúde pré e pós-operatórias dos suínos utilizando o índice de massa corporal (IMC). Calcule o IMC da seguinte forma:
IMC = peso corporal (kg)/(comprimento do corpo [cm] × comprimento do corpo [cm])
NOTA: O comprimento do corpo é medido do nariz do porco até a base da cauda. - Jejuar os animais por 12 h antes da cirurgia para evitar a aspiração após a anestesia. Prepare aparelhos de anestesia e instrumentos cirúrgicos, incluindo uma máquina de anestesia, gás, drogas anestésicas, uma tubulação de anestesia, um laringoscópio especial e instrumentos cirúrgicos, um retentor de costelas, suturas, um afastador da tireoide, pinça cirúrgica, etc. Esterilizar todos os instrumentos a serem utilizados na cirurgia.
2. Preparação dos animais para a cirurgia
- Pesar os animais e calcular a dose anestésica. Administrar por via intramuscular a mistura anestésica composta por 2 mg/kg de Tiletamina e Zolazepam 1:1, 0,2 mg/kg de diazepam e 0,02 mg/kg de atropina17. Utilizar fentanil (50 mg/kg) para alívio da dor intraoperatória30.
- Certifique-se de que um plano anestésico adequado seja alcançado e insira um cateter venoso de demora (20G) na veia marginal da orelha para estabelecer o acesso da orelha. Transfira o porco para a mesa de operação e coloque-o na posição supina. Imobilize os membros com ataduras e eleve a cabeça com uma cortina estéril.
NOTA: O estado da anestesia foi monitorado pela fixação central do globo ocular, miose, perda do reflexo pupilar e perda do reflexo da dor. A frequência cardíaca e a pressão arterial foram mantidas em um nível mais baixo do que a linha de base. O cirurgião deve monitorar a FC, a PA e outros parâmetros sob paralisia e aumentar a dose anestésica se a FC aumentar > 20% acima da linha de base. - Expor a epiglote e a glote usando um laringoscópio veterinário. Realize a intubação traqueal com um tubo de 7,0-7,5Fr e conecte-o ao circuito respiratório da anestesia.
NOTA: O ventilador é utilizado para ventilação por pressão positiva contínua com volume corrente de 280 mL, relação inspiratória/expiratória 1:2, frequência respiratória 20 vezes/min e pressão expiratória final positiva (5 cm H2O). - Injetar por via intravenosa brometo de vecurônio (0,1 mg/kg) para relaxar os músculos durante os procedimentos cirúrgicos e usar isoflurano a 2% para manter a anestesia a uma frequência respiratória de 16-20 bpm e um volume corrente de 10 mL/kg.
NOTA: O vecurônio é administrado para garantir a profundidade adequada da anestesia em animais paralisados, especialmente porque a dose do medicamento de indução e do isoflurano está na extremidade inferior do recomendado. - Use pomada veterinária nos olhos do porco para evitar a secura durante a anestesia. Use cobertores elétricos para manter a temperatura corporal do porco em 38 °C ± 5 °C.
- Use um eletrocardiograma para monitorar a frequência cardíaca, os níveis de oxigênio no sangue e a temperatura corporal.
3. Procedimentos cirúrgicos
- Raspar a parede torácica esquerda e aplicar três rodadas alternadas de iodo a 0,7% e álcool a 75% para preparar assepticamente a área cirúrgica até o ângulo mandibular esquerdo, até o cordão umbilical, esquerda até a linha axilar posterior e direita até a frente axilar. Coloque uma cortina cirúrgica estéril ao redor da área cirúrgica.
- Fazer uma incisão transversal de 7-10 cm com uma faca elétrica no terceiro espaço intercostal esquerdo e separar os tecidos subcutâneos camada por camada (Figura 2A). Retirar um segmento de 5-6 cm da terceira costela com tesoura óssea e expor a veia mamária interna por um afastador após exposição da terceira articulação costela-esternal (Figura 2B).
- Localize a veia mamária interna junto com a artéria mamária interna esquerda no lado esquerdo do esterno. Realizar uma dissecção contundente da veia mamária interna com pinça vascular.
- Realizar hemostasia por eletrocoagulação dos ramos da veia mamária interna esquerda com uma faca elétrica. Se a hemostasia estiver incompleta, use ligadura de fio de algodão para hemostasia. Ligue e marque as duas extremidades da veia enquanto ela está sendo colhida (Figura 2C).
- Preparar solução salina normal de heparina adicionando 2 mL de solução de heparina sódica e 98 mL de solução salina normal. Após a remoção da veia, injete solução salina normal de heparina na veia para pré-tratamento (Figura 2D). Em seguida, coloque a veia em solução salina normal e mantenha-a para backup.
- Faça uma incisão semelhante à descrita acima e remova a veia mamária interna no grupo simulado. Abra o pericárdio e, em seguida, feche a parede torácica no grupo simulado. Use a veia mamária interna do grupo simulado para controle patológico sem revascularização do miocárdio.
- Faça uma incisão de ~ 7 cm com uma faca elétrica no pericárdio para expor o tronco da artéria coronária direita. Suspender o pericárdio e costurar na pele do lado ipsilateral com as suturas cirúrgicas 1-0 (Figura 2E). Separe o tronco da artéria coronária direita dos tecidos circundantes (Figura 2E).
- Contornar a banda de bloqueio sob a extremidade proximal da artéria coronária direita isolada próxima à aorta com um gancho de arame e tratar o miocárdio com três ciclos de isquemia de 2 min e reperfusão de 5 min, apertando e relaxando a banda de bloqueio (Figura 2F). Monitorar a atividade elétrica do coração com o monitor de eletrocardiograma durante o pré-condicionamento de isquemia/reperfusão (Figura 2G).
NOTA: Quando a artéria coronária direita está bloqueada, o eletrocardiograma mostra aumento da frequência cardíaca e elevação do segmento ST. - Aperte a banda para bloquear o fluxo sanguíneo coronário direito. Corte o epicárdio que cobre os vasos sanguíneos. Exponha a parede da artéria coronária e corte longitudinalmente com a ponta de uma lâmina cirúrgica contra o centro da parede anterior dos vasos sanguíneos.
- Depois de cortar o lúmen, aumente a incisão com uma tesoura e coloque um shunt coronário. Insira uma extremidade do shunt com uma bobina na artéria coronária distal através da lágrima. Desviar o sangue nas artérias coronárias para o shunt coronário oco para garantir um campo operatório claro (Figura 2H).
- Realizar uma sutura contínua end-to-side entre a veia mamária interna e o tronco coronariano direito com a sutura de polipropileno 7-0 (Figura 2I). No meio da aorta ascendente, ocluir a parede anterolateral esquerda da aorta ascendente com uma braçadeira de semi-oclusão.
- Use uma lâmina cirúrgica para fazer uma pequena incisão na parede da aorta onde a adventícia foi cortada, insira a extremidade da cabeça do eixo deslizante na extremidade da cabeça do soco na cavidade aórtica através desta incisão, contraia o eixo deslizante para fora e a faca circular acima dele corta um pedaço da parede arterial. O bloco de tecido cortado pelo punch tem cerca de 3 mm de diâmetro (Figura 2J).
- Retire o shunt. Realizar uma sutura contínua end-to-side entre a veia mamária interna e a parede aórtica com a sutura de polipropileno 6-0 (Figura 2K). Abra a braçadeira de semi-oclusão.
- Registrar o fluxo de revascularização do miocárdio direito proximal ao local da anastomose usando ultrassonografia. Monitorar a atividade elétrica do coração usando o eletrocardiograma (Figura 2L).
- Habite um tubo de drenagem temporário (Fr: 16) na cavidade torácica para permitir que o sangue e os fluidos drenem. Costure a incisão de pericárdio usando um fio de algodão 1-0 e feche o peito camada por camada (de dentro para fora: camada de pleura, camada muscular, camada de tecido subcutâneo, camada de pele) enquanto coloca penicilina (cerca de 0,5 g) em pó em cada camada. Remova o tubo de drenagem depois de costurar a incisão da pele usando um fio de algodão 1-0.
4. Cuidados pós-cirúrgicos
- Remova o tubo endotraqueal após os animais retornarem à respiração espontânea. O anestesiologista deve avaliar os sinais vitais do animal (por exemplo, frequência respiratória, frequência cardíaca, saturação de oxigênio, etc.) e remover o ECG depois que os animais acordarem e retornarem à atividade espontânea. Envie os animais de volta para a sala de alimentação e coloque os animais falsos em outro curral na sala de reprodução. Mantenha os animais aquecidos com um cobertor elétrico. Observe os animais a cada hora após a cirurgia (pelo menos 4 vezes).
- Alimente o animal no dia seguinte à cirurgia. Adicione aspirina (200 mg) 2x ao dia por 7 dias à ração animal para prevenir a trombose pós-operatória e reduzir a dor da ferida.
NOTA: Evite alimentar os animais no dia da cirurgia para evitar a aspiração. - Administrar o animal com uma injeção intramuscular de penicilina 1x ao dia por 7 dias consecutivos para prevenir a infecção pós-operatória (14.000 unidades por kg).
5. Exame ultra-sônico
- Após a cirurgia de revascularização miocárdica, use uma manga de sonda ultrassônica estéril para envolver a sonda de matriz linear de alta frequência. Coloque a sonda na superfície do enxerto venoso.
- Exiba o contorno do enxerto no modo de ultrassom bidimensional e, em seguida, mude para o modo Doppler colorido para detectar o fluxo sanguíneo no enxerto.
6. Coleta de tecido do enxerto venoso
- Coletar 10 mL de amostra de sangue do circuito venoso da veia da orelha para testes bioquímicos. (Tabela 1). Centrifugar a amostra de sangue a 1.000 x g por 5 min e realizar testes bioquímicos com um analisador bioquímico automático.
- Anestesiar o animal como descrito anteriormente. Após a confirmação da profundidade da anestesia, injete cloreto de potássio a 10% a 0,5mL/kg de peso corporal da veia marginal da orelha ou da veia do membro anterior. Em seguida, faça uma incisão esternal mediana de 10 cm com uma faca elétrica para colher o enxerto de veia 30 dias após a cirurgia. Fixe a posição do corpo como na etapa 2.2., e após a esterilização e colocação de uma cortina, faça uma incisão no esterno mediano para dividir o esterno. Durante a separação, evite os principais vasos sanguíneos e o coração e separe os vasos sanguíneos enxertados camada por camada.
- Corte rapidamente os grandes vasos sanguíneos que se conectam ao coração, coloque o coração e a aorta ascendente em lascas de gelo e remova a ponte vascular do enxerto, a aorta conectada e a artéria coronária direita. Enxaguar todas as amostras com solução salina normal a 4 °C.
- Pegue todo o vaso do enxerto de cerca de 3-4 cm de tamanho, divida-o em 4-5 partes iguais e transfira para tubos de criopreservação. Coloque rapidamente os tubos em nitrogênio líquido para congelar e mova-se para um freezer de temperatura ultrabaixa de -80 °C para armazenamento.
- Para análise, enxaguar o enxerto com solução salina gelada a 0,9% e fixá-lo em solução de paraformaldeído a 4%. Mantenha uma proporção do tamanho do bloco de tecido para a solução fixadora de 1:10 e fixe o tecido por mais de 12 h.
- Coloração das seções em 50 mL de solução aquosa de hematoxilina por 3 min. Separe as seções lavando com 50 mL de etanol de ácido clorídrico a 0,5% e 50 mL de água de amônia a 0,2% por 10 s cada.
- Enxaguar com água corrente por 1 h e depois limpar em água destilada de molho por 3 min. Desidratar em etanol a 70% e 90% por 10 min cada. Coloque em 50 mL de solução de coloração de eosina alcoólica a 0,5% por 2-3 min.
- Desidrate as seções coradas com etanol puro por 10 min e, em seguida, mergulhe em xileno puro por 10 min para tornar as amostras transparentes. Goteje as seções transparentes com cola neutra e cubra com uma tampa. Observe seções patológicas sob um microscópio de luz com ampliação de 40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IMC e índices bioquímicos séricos
O IMC entre os grupos sham e VGD não foi significativamente diferente (sham vs. VGD, 22,05 kg/cm 2 ± 0,46 kg/cm 2 vs. 21,14 kg/cm 2 ± 0,39 kg/cm 2, p = 0,46). Os resultados bioquímicos séricos estão listados na Tabela 1. Mudanças estatisticamente significativas entre os grupos foram encontradas em quatro índices bioquímicos, incluindo aspartato aminotransferase (AST, sham vs. VGD, 25,25 UI/L ± 1,88 UI/L vs. 31,5 UI/L ± 2,58 UI/L), bilirrubina sérica (sham vs. VGD, 2,5 μmol/L ± 0,47 μmol/L vs. 4,5 μmol/L ± 0,14 μmol/L), bilirrubina total (sham vs. VGD, 0,025 μmol/L ± 0,14 μmol/L vs. 0,92 μmol/L ± 0,33 μmol/L), e creatinina (sham vs. VGD, 92,75 μmol/L ± 4,15 μmol/L vs. 141,75 μmol/L ± 12,65 μmol/L).
Exame ultra-sônico
Todos os animais dos grupos sham (n = 5) e VGD (n = 5) sobreviveram. Os procedimentos cirúrgicos da CRM são apresentados na Figura 1. O tempo médio de operação foi de 105 min ± 25 min (variação: 90-160 min) e o volume médio de sangramento intraoperatório foi de 85 mL ± 35 mL (variação: 50-200 mL). A influência do tempo de operação é principalmente a transição da proficiência do operador de humano para porco e não tem significado especial. A duração média da anastomose após a incisão até a extubação traqueal foi de 17 min ± 5 min (variação: 15-30 min). O exame ultrassonográfico mostrou que o suprimento sanguíneo do vaso enxertado apresentava regurgitação parcial em comparação com a artéria coronária normal, e a direção geral do fluxo sanguíneo era geralmente normal (Figura 3). Pneumotórax, tamponamento, infecção ou outras complicações graves não foram observadas no pós-operatório. Não foi encontrada diferença significativa no peso ou IMC entre os grupos sham e VGD, 1 mês de pós-operatório.
O exame ultrassônico foi realizado na extremidade proximal (Figura 3A,B), cavidade vascular (Figura 3C,D) e extremidade distal (Figura 3E,F) do vaso do enxerto. O fluxo retrógrado foi observado nas extremidades proximal e distal do vaso do enxerto; no entanto, não foi observado extravasamento sanguíneo.
Alterações patológicas nas veias
Cada enxerto venoso foi dividido uniformemente em três segmentos por comprimento, e uma seção foi selecionada de cada segmento para avaliação e classificada de acordo com a classificação de Proudilit modificada para estenose da artéria coronária18. Os valores médios das três seções foram adotados como resultados para o grau de oclusão. A classificação específica foi a seguinte: grau I = 0 ponto, normal sem reestenose; grau II = estenose leve de 1 ponto <30%; grau III = 2 pontos, estenose entre 30% e 50%; grau IV = 3 pontos, estenose grave entre 50% e 90%; grau V = 4 pontos, oclusão subtotal >90%; e grau VI = 5 pontos, oclusão total, sem fluxo sanguíneo para o enxerto venoso. A classificação de Proudilit modificada para estenose da artéria coronária foi adotada para avaliar os resultados quantificados. O resultado para o grupo sham foi de 0,00 ± 0,00, indicando ausência de oclusão vascular, enquanto o resultado para o grupo CRM foi de 3,12 ± 1,22. Portanto, a diferença foi significativa entre os dois grupos (p < 0,05, Tabela 2).
Ao microscópio, no grupo simulado, a túnica íntima, a túnica média e a parede venosa do enxerto venoso pareciam normais. No grupo VGD, a túnica íntima e o meio túnica dos enxertos venosos foram significativamente espessados 30 dias após a cirurgia de revascularização miocárdica. A túnica íntima foi demarcada de forma ambígua da túnica média. A camada elástica da túnica média desapareceu (Figura 4). O lúmen do enxerto venoso foi preenchido com tecido hiperplásico (Figura 4). Não foi observada alteração significativa no diâmetro do vaso.
Figura 1: Esboço do procedimento. (A-C) Pré-operação: Pesar os minipigs, verificar o desempenho do desfibrilador e do ventilador e conectar o tubo de ventilação. (D-F) Anestesia: Administrar uma injeção intramuscular de anestesia aos minipigs, fixar o minipig na mesa de operação, expor totalmente as vias aéreas para intubação traqueal, conectar o ventilador e usar anestesia inalatória para manter a anestesia. (G-I) Durante a operação: Realizar uma avaliação ultrassonográfica pré-operatória da função cardíaca nos minipigs e revascularização do miocárdio completa através de uma incisão na parede torácica esquerda. (J-L) Pós-operação: Anastomose as feridas e preste atenção aos cuidados pós-operatórios e alimentação dos miniporcos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O procedimento cirúrgico. (A) Cortar a parede torácica, (B) isolar a veia mamária interna, (C) remover a veia mamária interna, (D) realizar pré-condicionamento da heparina, (E) suspender o pericárdio, (F) realizar reperfusão de isquemia miocárdica, (G) monitorar as alterações do ECG, (H) bloquear o fluxo sanguíneo coronariano, (I) anastomosar a extremidade proximal do vaso do enxerto, (J ) local da anastomose coronariana distal, (K) anastomoses distais às artérias coronárias, (L) revascularização do miocárdio completa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exame ultrassônico. Após a conclusão da revascularização do miocárdio, a permeabilidade do fluxo sanguíneo do vaso enxertado é avaliada por ultrassonografia. (A, C, E) Imagens normais do fluxo sanguíneo coronário. Sinais de fluxo sanguíneo contínuo são vistos nas extremidades (B) proximal, (D) média e (F) distal dos vasos enxertados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise histológica . (A) O corte patológico normal da veia mamária interna mostrou clara hierarquia vascular e ausência de estenose lúmen. (B,C) A patologia da veia mamária interna 30 dias após o transplante de artéria coronária mostrou que a íntima do vaso estava espessada em graus variados, e o lúmen estava obviamente estreitado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Indicadores | Grupo Sham (n=5) | Grupo Enxerto (n=5) |
| ALT (UI/L) | 46 ±5,11 | 47,75±7,88 |
| AST (UI/L) | 25,25 ±1,88 | 31,5±2,58* |
| Proteína Total (UI/L) | 63,12 ±,138 | 60,17±1,91 |
| Albumina (UI/L) | 32,25 ±0,77 | 23,77±5,61 |
| Globulina (g/L) | 30,87 ±,136 | 36,4±6,03 |
| Bilirrubina sérica (μmol/L) | 2,5 ±0,47 | 4,5±0,14* |
| Bilirrubina total (μmol/L) | 0,025 ±0,14 | 0,92±0,33* |
| Fosfatase alcalina (UI/L) | 103 ±19,3 | 16±104.04 |
| Glucosamina (mmol/L) | 4,44 ±0,36 | 5,96±0,42 |
| Nitrogênio ureico (mmol/L) | 2,46 ±0,17 | 2,89±0,65 |
| Creatinina sérica μmol/L | 92,75 ±4,15 | 141,75±12,65* |
| Colesterol total (mmol/L) | 2,37 ±0,12 | 2.16±0.06 |
| Triglicerídeos (mmol/L) | 0,48 ±0,10 | 0,25±0,05 |
| Lipoproteína de alta densidade mmol / L | 1,05 ±0,07 | 1.03±0.07 |
| Lipoproteína de Densidade Muito Baixa (mmol/L) | 1,43 ±0,06 | 1.29±0.04 |
| Lactato Desidrogenase (mmol/L) | 384,75 ±26,8 | 478.25±49.58* |
Tabela 1. Indicadores bioquímicos séricos. Para a análise foi utilizado um software de análise estatística. Os dados foram expressos em média ± erro padrão (n = 5). As comparações dos dados das medidas foram analisadas pelo teste t de Student. Um valor de p menor que 0,05 indicou significância estatística. *p < 0,05, CRM vs. simulação.
| Classificação Proudilit | ||||||
| S. N.º da amostra | Escore imediatamente após a cirurgia de revascularização miocárdica | Escore 30 dias após a cirurgia de revascularização miocárdica | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Tabela 2. Resultados estatísticos dos graus de oclusão do enxerto imediatamente após a cirurgia e 30 dias de pós-operatório. A escala de classificação de Proudilit modificada foi utilizada para o grau de oclusão vascular: grau I = 0 ponto, normal sem reestenose; grau II = estenose leve de 1 ponto <30%; grau III = 2 pontos, estenose entre 30% e 50%; grau IV = 3 pontos, estenose grave entre 50% e 90%; grau V = 4 pontos, oclusão subtotal >90%; e grau VI = 5 pontos, oclusão total, sem fluxo sanguíneo para o enxerto venoso. Os dados incluem resultados de cinco enxertos venosos divididos uniformemente em três seções por comprimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste estudo, descrevemos detalhadamente o protocolo de seleção de animais, preparo de instrumentos, procedimentos cirúrgicos e avaliação pós-operatória ao desenvolver um modelo de DVG induzida por CRM. Realizamos exame ultrassônico do enxerto venoso antes e após a cirurgia de revascularização miocárdica e exame histológico do enxerto 30 dias após a cirurgia. O fluxo sanguíneo na veia mamária interna foi normal antes da cirurgia de revascularização miocárdica, enquanto o fluxo retrógrado foi observado no enxerto da veia mamária interna. Em comparação com o grupo de operação simulada, a função hepática e renal dos animais no grupo de operação foi danificada até certo ponto. Considerando a ocorrência de doença do enxerto coronariano, o enfraquecimento da contratilidade miocárdica resultou em perfusão insuficiente dos tecidos periféricos. O enxerto venoso apresentou hiperplasia intimal e remodelamento vascular 30 dias após a cirurgia de revascularização miocárdica (Figura 4). As alterações fibróticas ao redor dos vasos sanguíneos estão associadas à cicatrização de feridas, a proliferação de fibroblastos ocorre no início da cicatrização de feridas no dia 1 ao dia 3 19, a produção de colágeno e fibronectina tipo I ativos ocorre no dia 4 ao dia 6 e a agregação da fibrila de actina citoplasmática α-SM ocorre no dia 7 ao dia 1419. As fibras de estresse implicam na formação de miofibroblastos, o que coincide com a contração da ferida20. Não está claro se a fibrose perivascular afeta os resultados cirúrgicos.
Aqui, selecionamos miniporcos para estabelecer o modelo de doença do enxerto venoso. Enquanto pequenos animais, como ratos, têm sido utilizados para estudar os mecanismos patológicos da DVG21, os suínos são semelhantes em tamanho, anatomia e fisiologia aos seres humanos e, portanto, são mais adequados para estudar a patogênese da cardiopatia humana ou como ferramenta para o desenvolvimento de dispositivos22. As veias mamárias internas também são frequentemente selecionadas como enxertos clinicamente. Estudos clínicos de dois grupos independentes encontraram que os enxertos de veia mamária interna têm a característica de alta incidência de lesões de enxertos venosos, e as mesmas alterações patológicas foram observadas em nosso estudo (Figura 4)23,24. Assim como na prática clínica, a seleção de uma abordagem cirúrgica adequada em cirurgia animal é fundamental para o sucesso da cirurgia; aqui, referimo-nos à toracotomia esquerda deHocum 11. Descobrimos que a toracotomia esquerda poderia expor claramente o campo operatório, a anatomia ao redor da incisão era fácil de identificar e a quantidade de sangramento era baixa. Além disso, em comparação com a toracotomia mediana, a toracotomia lateral não requer serragem do esterno, de modo que o estresse cirúrgico pode ser reduzido.
A anestesia é crucial para o sucesso de um modelo cirúrgico. Neste estudo, o protocolo foi modificado de Kotani et al., com a combinação de cetamina e diazepam utilizada como indução anestésica e inalação de isoflurano como anestesia de manutenção25. Além disso, um grupo de pesquisa mostrou que os medicamentos intravenosos também eram adequados para anestesia de manutenção26. A intubação endotraqueal em suínos pode ser difícil para uma equipe cirúrgica animal. Em comparação com a via aérea humana, a anatomia traqueal dos suínos dificulta a exposição da glote27. Aqui, para melhor expor a glote, pressionamos a mandíbula superior do porco para ajudar a expor a glote do porco (Figura 1D). Por outro lado, o uso de laringoscopia direta ou broncoscopia por fibra óptica ajudará a visualizar a glote na intubação endotraqueal28.
O estado patológico da doença do enxerto venoso é dividido principalmente em três estágios: 1) trombose em estágio agudo (dentro de 1 mês); 2) hiperplasia intimal em estágio subagudo (1-12 meses); 3) formação tardia (mais de 12 meses) de aterosclerose, que é causa de estenose e oclusão do enxerto29. A maioria das alterações na fase aguda da DVG está relacionada a fatores operacionais, e a aterosclerose formada no estágio tardio é irreversível. O estudo do espessamento endometrial subagudo é muito importante para a patogênese, tratamento e prevenção da DVG. Também é fundamental que os vasos do enxerto escolhidos sejam diferentes dos vasos verticais da veia safena magna. A veia mamária interna geralmente tem menos pressão hidrostática, e as alterações patológicas são mais rápidas após o transplante do que para a veia safena magna. Em nosso modelo, hiperplasia intimal típica ocluindo o lúmen do vaso enxertado foi observada no exame histológico 30 dias após a cirurgia, e as mesmas alterações patológicas foram observadas em outros estudos clínicos23,24. Os resultados da modelagem da seleção da veia mamária interna em minipigas são estáveis no fenótipo, o tempo de modelagem é curto e o grau de redução das alterações patológicas da DVG é alto, o que é propício para o desenvolvimento de pesquisas de acompanhamento.
O modelo também tem algumas limitações. Algumas operações finas no processo de modelagem de animais de grande porte, monitoramento intraoperatório de sinais vitais de animais e ressuscitação pós-operatória exigem certa experiência prática, o que requer cirurgiões profissionais e anestesiologistas para orientar o treinamento e reduzir muito a mortalidade acidental de animais. A cirurgia de animais de grande porte requer locais experimentais específicos, pessoal profissional e apoio financeiro suficiente, o que pode ser um fardo mais pesado para institutos menores.
Em conclusão, sob a orientação de profissionais, laboratórios bem equipados podem estudar ainda mais as alterações patológicas da DVG, estabelecendo este modelo de DPV minipig, que é de grande importância para o tratamento da DVG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Instituto de Monitoramento de Animais de Laboratório de Guangdong pelo apoio técnico, cuidados com animais e coleta de amostras. Eles também agradecem Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, para o apoio técnico no exame ultra-sônico. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Guangdong, China, e pelo Projeto de Despesas Empresariais de Pesquisa Científica Básica das Universidades Científicas da Universidade de Jinan (2017A020215076, 2008A08003 e 21621409).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
References
- Lloyd-Jones, D., et al. Executive summary: Heart disease and stroke statistics--2010 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 121 (7), 948-954 (2010).
- Taggart, D. P. Contemporary coronary artery bypass grafting. Frontiers of Medicine. 8, 395-398 (2014).
- Wolny, R., Mintz, G. S., Pregowski, J., Witkowski, A. Mechanisms, prevention and treatment of saphenous vein graft disease. The American Journal of Cardiology. 154, 41-47 (2021).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 30 (3), 451-463 (2006).
- Suggs, W. D., et al. Antisense oligonucleotides to c-fos and c-jun inhibit intimal thickening in a rat vein graft model. Surgery. 126 (2), 443-449 (1999).
- Jiang, Z., et al. A novel vein graft model: Adaptation to differential flow environments. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (1), H240-H245 (2004).
- O'Brien, J. E., et al. Early injury to the media after saphenous vein grafting. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (5), 1273-1278 (1998).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. The American Journal of Pathology. 153 (4), 1301-1310 (1998).
- Klyachkin, M. L., et al. Postoperative reduction of high serum cholesterol concentrations and experimental vein bypass grafts. Effect on the development of intimal hyperplasia and abnormal vasomotor function. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 108 (3), 556-566 (1994).
- Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727 (2021).
- Hocum Stone,, L, L., et al. Magnetic resonance imaging assessment of cardiac function in a swine model of hibernating myocardium 3 months following bypass surgery. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 153 (3), 582-590 (2017).
- Gedik, N., et al. Proteomics/phosphoproteomics of left ventricular biopsies from patients with surgical coronary revascularization and pigs with coronary occlusion/reperfusion: Remote ischemic preconditioning. Scientific Reports. 7 (1), 7629 (2017).
- Tsirikos Karapanos,, N,, et al. The impact of competitive flow on distal coronary flow and on graft flow during coronary artery bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 12 (6), 993-997 (2011).
- Meng, X., et al. Competitive flow arising from varying degrees of coronary artery stenosis affects the blood flow and the production of nitric oxide and endothelin in the internal mammary artery graft. European Journal of Cardio-thoracic Surgery: Official Journal of the. 43 (5), 1022-1027 (2013).
- Thankam, F. G., et al. Association of hypoxia and mitochondrial damage associated molecular patterns in the pathogenesis of vein graft failure: A pilot study. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. , 38-52 (2021).
- Li, X., et al. A surgical model of heart failure with preserved ejection fraction in Tibetan minipigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 180 (180), 63526 (2022).
- Rueda, A. lcalá, I,, et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology: Official Journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies (EUFOS): Affiliated with the German Society for Oto-Rhino-Laryngology - Head and Neck Surgery. 278 (8), 3081-3090 (2021).
- Proudfit, W. L.
- Clark, R. A. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. TheAmerican Journal of the Medical Sciences. 306 (1), 42-48 (1993).
- Darby, I., Skalli, O., Gabbiani, G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation. 63 (1), 21-29 (1990).
- Sterpetti, A. V., et al. Formation of myointimal hyperplasia and cytokine production in experimental vein grafts. Surgery. 123 (4), 461-469 (1998).
- Shannon, A. H., et al. Porcine model of infrarenal abdominal aortic aneurysm. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 153 (153), (2019).
- Langille, B. L., O'Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231 (4736), 405-407 (1986).
- Zwolak, R. M., Adams, M. C., Clowes, A. W. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. Journal of Vascular Surgery. 5 (1), 126-136 (1987).
- Kotani, K., et al. A subacute hypoxic model using a pig. Surgery Today. 35 (11), 951-954 (2005).
- Liu, D., et al. Comparison of ketamine-pentobarbital anesthesia and fentanyl-pentobarbital anesthesia for open-heart surgery in minipigs. Lab Animal. 38 (7), 234-240 (2009).
- Geovanini, G. R., Pinna, F. R., Prado, F. A., Tamaki, W. T., Marques, E. Standardization of anesthesia in swine for experimental cardiovascular surgeries. Revista Brasileira de Anestesiologia. 58 (4), 363-370 (2008).
- Alhomary, M., Ramadan, E., Curran, E., Walsh, S. R. Videolaryngoscopy vs. fibreoptic bronchoscopy for awake tracheal intubation: A systematic review and meta-analysis. Anaesthesia. 73 (9), 1151-1161 (2018).
- Parang, P., Arora, R. Coronary vein graft disease: Pathogenesis and prevention. Canadian Journal of Cardiology. 25 (2), e57-e62 (2009).
- Egan, T. D., et al. Fentanyl pharmacokinetics in hemorrhagic shock: a porcine model. Anesthesiology. 91 (1), 156-166 (1999).
