Differensial dynamisk mikroskopi (DDM) kombinerer egenskaper ved dynamisk lysspredning og mikroskopi. Her presenteres prosessen med å bruke DDM til å karakterisere rekonstituerte cytoskjelettnettverk ved å kvantifisere den subdiffusive og burede dynamikken av partikler i vimentinnettverk og den ballistiske bevegelsen av aktive myosindrevne aktin-mikrotubule kompositter.
Celler kan krype, helbrede seg selv og justere stivheten på grunn av deres bemerkelsesverdig dynamiske cytoskjelett. Som sådan kan rekonstituering av nettverk av cytoskeletal biopolymerer føre til en rekke aktive og tilpasningsdyktige materialer. Imidlertid krever prosjektering av slike materialer med nøyaktig innstilte egenskaper å måle hvordan dynamikken avhenger av nettverkssammensetningen og syntesemetodene. Kvantifisering av slik dynamikk utfordres av variasjoner på tvers av tid, rom og formuleringsrom for sammensatte nettverk. Protokollen her beskriver hvordan Fourier-analyseteknikken, differensial dynamisk mikroskopi (DDM), kan kvantifisere dynamikken i biopolymernettverk og er spesielt godt egnet for studier av cytoskjelettnettverk. DDM arbeider med tidssekvenser av bilder som er anskaffet ved hjelp av en rekke mikroskopimodaliteter, inkludert laserskanning konfokal, widefield fluorescens og brightfield-avbildning. Fra slike bildesekvenser kan man trekke ut karakteristiske dekorasjonstider for tetthetssvingninger over et spenn av bølgevektorer. En brukervennlig Python-pakke med åpen kildekode for å utføre DDM-analyse er også utviklet. Med denne pakken kan man måle dynamikken i merkede cytoskjelettkomponenter eller innebygde tracerpartikler, som vist her med data fra mellomliggende filamentnettverk (vimentin) og aktive actin-microtubule-nettverk. Brukere uten tidligere programmerings- eller bildebehandlingserfaring vil kunne utføre DDM ved hjelp av denne programvarepakken og tilhørende dokumentasjon.
Cytoskjelettet er et nettverk av proteinfilamenter som spenner over cytoplasma av eukaryote celler, og forbinder celleoverflaten med kjernen. Den har unike materialegenskaper, noe som gir mekanisk beskyttelse mot store og gjentatte mekaniske belastninger, men driver også dynamisk celleformendringer1. Rekonstituerte cytoskjelettnettverk kan gi opphav til en rekke interessante dynamiske atferd, fra kaging av innebygde partikler til ballistisk bevegelse drevet av molekylære motorer 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Metoder for å analysere dynamikken i slike nettverk inkluderer sporing av bevegelsen til innebygde tracermikrosfærer 6,7,12,13,14, bildeanalyse for å spore størrelsen på protein-tette klynger over tid8, dynamisk lysspredning15, partikkelbilde velocimetry 4,16,17,18,19 , beregne kraftspektral tettheten til bilder over tid19 og kymografianalyse20. Etter hvert som flere studier på rekonstituerte cytoskjelettnettverk utføres, blir det stadig mer nødvendig å forstå cellulær mekanikk eller aktiv materie, robuste, objektive og reproduserbare metoder for å karakterisere dynamikken. Differensial dynamisk mikroskopi (DDM)21,22, en relativt ny teknikk som har blitt brukt til å studere cytoskjelettdynamikk, er en slik teknikk som effektivt kvantifiserer dynamikken med få brukerdefinerte parametere. Med programvarepakken som er beskrevet her, vil forskere med liten erfaring innen programmering eller bildeanalyse kunne utnytte DDM for sitt eget arbeid.
DDM er en bildeanalyseteknikk for å trekke ut et utvalgsdynamikk. I likhet med partikkelsporing eller partikkelbildehastighet krever DDM en tidsserie med bilder (ofte tusenvis av bilder), vanligvis tatt opp med et mikroskop. I motsetning til partikkelsporing trenger ikke individuelle funksjoner eller tracerperler å lokaliseres (eller til og med være lokalisert) i bildet. I motsetning til både partikkelsporing og partikkelbildehastighet, gjenoppretter man ensembledynamikken med DDM med relativt få brukerspesifiserte parametere. Med DDM analyseres bilder i Fourier-rommet for å bestemme forfallstiden for tetthetssvingninger over en rekke bølgetall, q, hvor q = 2πu, og u er størrelsen på de romlige frekvensene, . Man får spredningslignende informasjon, men med bilder fra det virkelige rommet ervervet på et mikroskop 21,22,23. Derfor kan man dra nytte av de forskjellige kontrastgenererende metodene for mikroskopi, for eksempel widefield fluorescens22,24, konfomisk fluorescens25, polarisert26, mørkfelt27 eller lysarkfluorescens28 mikroskopier. Videre kan bilder som brukes til DDM-analyse brukes til partikkelsporing eller partikkelbildehastighet for å gi komplementær informasjon.
Denne kombinasjonen av funksjoner fra dynamisk lysspredning og optisk mikroskopi gjør DDM til en kraftig og allsidig teknikk. Siden den første beskrivelsen av Cerbino og Trappe i 200821, der DDM ble demonstrert for å måle diffusjonen av 73 nm kolloidale partikler, har DDM blitt brukt til å måle flytende kolloider29, kolloidal aggregering30,31, viskoelastisiteten til nematiske væskekrystaller26, dynamikken i kolloidale geler32, grove skum33, nanopartikler i trange miljøer34, 35,36,37, bakteriell bevegelighet 38,39,40,41, diffusjon av svakt spredning protein klynger 42, kapillære bølger ved flytende grensesnitt43, og andre systemer. De som leter etter en mer fullstendig liste over publikasjoner som bruker DDM, kan se grundige gjennomgangsartikler om emnet 22,23,44,45.
DDM har også blitt brukt til å undersøke dynamikken i biologiske nettverk. Drechsler et al. brukte DDM til å måle dynamikken i aktin i levende Drosophila oocytter46. Burla et al. kvantifiserte dynamikken i sporstoffpartikler i nettverk av hyaluronan og hyaluronan-kollagenkompositter47. Flere bruksområder for DDM for å studere dynamikken i sporstoffpartikler i rekonstituerte cytoskjelettnettverk 9,10, transport av DNA-molekyler i slike nettverk48,49, og dynamikken i aktive rekonstituerte nettverk har også blitt dokumentert 11,50,51. En fordel med DDM i å måle dynamikken i slike systemer er at individuelle partikler eller molekyler ikke trenger å lokaliseres og spores. Så for eksempel kan dynamikken i DNA-molekyler i overfylte miljøer måles med DDM til tross for vanskeligheten med å spore slike små og ikke-sfæriske molekyler. Videre, med fluorescensmikroskopi, kan man bruke flerfarget merking for å selektivt måle dynamikken til individuelle bestanddeler i en kompleks kompositt.
For å utføre DDM blir en sekvens av bilder tatt over tid, I (x, y, t). For en gitt oppholdstid blir Δt, alle (eller et delsett av) par med bilder atskilt med denne oppholdstiden funnet. Den kvadrert Fourier-transformasjonen av forskjellen i hvert par,
beregnes og beregnes sammen. Denne mengden, , er radialt gjennomsnittet, forutsatt at dynamikken er isotropisk. Dette gir DDM-matrisen (også kalt bildestrukturfunksjonen), . Denne prosessen vises grafisk i figur 1. For å bestemme utvalgets dynamikk fra denne DDM-matrisen antas DDM-matrisen å ta skjemaet
hvor A er amplituden, som avhenger av detaljene i mikroskopet og strukturen til prøven, B er bakgrunnen, som avhenger av støyen i bildene, og f (q, Δt) er mellomliggende spredningsfunksjon (ISF), som inneholder informasjon om dynamikken21,22. I enkle tilfeller
der τ er en karakteristisk forfalls- eller dekorasjonstid. En slik ISF har blitt brukt i flere studier som benytter DDM på ergodiske systemer som fortynnede kolloidale suspensjoner 21,24,27,37,40,52. Andre former for ISF kan imidlertid brukes til å modellere ulike typer dynamikk. Man kan for eksempel bruke en kumulantutvidelse til å modellere ISF for polydisperseprøver som
hvor μ er et mål på polydispersiteten42,53; hvis tetthetssvingninger forfaller med to separate moduser, kan man bruke en ISF-lignende
26, 54, 55, 56, 57;
andre ISF-er kan brukes til svømming av mikroorganismer eller andre aktive partikler 38,39,40,41,58,59.
Figur 1: Oversikt over DDM-analyse. Fra tidsserien med bilder beregnes Fourier-transformeringen av bildeforskjeller for å beregne DDM-matrisen. DDM-matrisen kan tilpasses en modell for å bestemme tidsskalaen for tetthetssvingninger på tvers av en rekke q-verdier . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Her beskrives bruken av en DDM-analyseprogramvarepakke utviklet i Python, PyDDM. Denne programvarepakken bygger på arbeidet som er gjort av våre forskningslaboratorier og andre publiserte studier de siste årene. Primære motivatorer for å lage denne programvarepakken inkluderer behovet for (1) å holde oversikt over og lagre metadata og parametere som brukes i analysen; (2) grundig dokumentasjon med detaljerte eksempler på analyse fra start til slutt; og (3) en enkel måte å bruke forskjellige (eller lage nye) matematiske modeller for å tilpasse dataene (f.eks. å legge til ISF-modeller, for eksempel de som nylig er utviklet for aktive filamenter60, ville være enkle). Andre programvarepakker for DDM-analyse eksisterer også, men ikke alle er godt dokumentert og skrevet i et åpen kildekode-programmeringsspråk. Det finnes for eksempel C++-kode med databehandling på GPU-er (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, C++-kode som bruker Fourier-transformeringer i tide for å øke hastigheten på beregninger (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61-, MATLAB- og Python-versjoner (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB-kode (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 og MATLAB-kode med usikkerhets kvantifisering ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Siden denne PyDDM-pakken er godt dokumentert og gir mye fleksibilitet i hvordan DDM-matrisen beregnes og analyseres, kan den forhåpentligvis være nyttig for forskere som ønsker å implementere DDM uavhengig av bakgrunn i programmering eller bildeanalyse.
Protokollen viser hvordan denne programvarepakken kan brukes til å kvantifisere dynamikken i in vitro rekonstituerte cytoskeletonnettverk. Dette gjøres ved hjelp av to forskjellige sett med bildedata: (1) bilder av submikronsporerpartikler innebygd i et vimentinnettverk tatt med brightfield-mikroskopi og (2) bilder av fluorescerende merket aktin- og mikrotubulfilamenter i et innviklet komposittnettverk med myosindrevet aktivitet tatt med laserskanning konfokal mikroskopi. Analysene av disse to datasettene fremhever bemerkelsesverdige styrker av DDM, inkludert dens evne til å analysere bilder tatt med en rekke bildemodaliteter (f.eks. brightfield eller confocal fluorescence), for å trekke ut dynamikk fra enten innebygde sporstoffer eller fra merkede filamenter, og for å kvantifisere en rekke dynamikker (f.eks. subdiffusive og begrensede eller ballistiske).
Programvarepakken som er beskrevet her, bruker DDM til å analysere tetthetssvingninger observert i bilder som er anskaffet ved hjelp av et optisk mikroskop. Representative resultater fra data fra sporstoffer partikler innebygd i vimentin nettverk ble først vist. Analysen av slike data kan brukes til å karakterisere nettverkets maskestørrelse og stivhet på samme måte som hvordan enkeltpartikkelsporing har blitt brukt i mange tidligere studier av cytoskjelettnettverk 6,12,13. En fordel med å bruke DDM over enkeltpartikkelsporing er at DDM ikke krever at partiklene lokaliseres. Derfor, selv i bilder der partikkeltettheten er for høy eller partiklene for små til å lokalisere og spore, kan DDM fortsatt bestemme dynamikken. Hvor enkeltpartikkelsporing vil være fordelaktig er ved inspeksjon av partikkel-til-partikkelvariabilitet. Med DDM finner man ensemblets gjennomsnittlige dynamikk, mens man med enkeltpartikkelsporing kan beregne både en enkelt partikkels MSD og den ensemblegjennomsnittte MSD. DDM kan imidlertid brukes til å undersøke heterogen dynamikk ved å analysere flere interesseområder innenfor et stort synsfelt.
Deretter ble representative resultater fra data av fluorescerende merkede filamenter i et aktivt nettverk sammensatt av to forskjellige merkede cytoskeletale filamenttyper vist11. Med disse dataene ble den ballistiske bevegelsen karakterisert uten å trenge noen lokaliserte funksjoner i bildet. Siden DDM trekker ut ensemblets gjennomsnittlige dynamikk med få brukerinnganger, gjør det det enkelt å sammenligne bildeserier oppnådd med forskjellige forhold (f.eks. sammenligne prøver med forskjellige forhold mellom aktin og mikrotubuler eller prøver med forskjellige konsentrasjoner av myosin, som gjort i50). I tillegg, ved hjelp av fluorescerende avbildning, kan vi undersøke dynamikken i forskjellige komponenter i et nettverk ved hjelp av flerfarget merking. Dette ble gjort i 11,50, hvor dynamikken i aktin og mikrotubuler ble separat analysert i et aktivt aktin-mikrotubul sammensatt nettverk ved hjelp av flerfarget bildebehandling. I den representative resultatseksjonen her ble bare resultatene fra mikrotubulkanalen vist, men i tidligere arbeid sammenlignet vi dynamikken i mikrotubulen og aktinfilamentene11.
Vi merker oss at disse representative resultatene viser enten passiv subdiffusion eller aktiv ballistisk bevegelse. Det er viktig at DDM brukes til å analysere systemer der det er en crossover i typen dynamikk på mellomtids- eller lengdeskalaer. Som eksempler brukte Kurzthaler et al. DDM med et system av aktive Janus-kolloider for å utforske aktiv rettet bevegelse på korte tidsskalaer og randomisering av orienteringen på lengre tidsskalaer59; Giavazzi et al. brukte DDM med grovt skum og fant en crossover i dynamikken som tilsvarer lengdeskalaen til en boble33; og Cho et al. brukte DDM med kolloidale geler og fant tre skilleregimer i forskjellige lengdeskalaer som spenner fra fraktalklyngene til hele nettverket32.
Dataene som inngår i den representative resultatseksjonen ble innhentet med brightfield mikroskopi og laserskanning konfektmikroskopi. Som tidligere nevnt kan imidlertid DDM brukes med mange bildemodaliteter. Med enhver bildemodalitet bør brukerne vurdere optiske innstillinger som graden av optisk seksjonering eller dybdeskarpheten. En høy grad av optisk seksjonering kan redusere signalet fra objekter utenfor fokus, men man vil ikke kunne måle dynamikken nøyaktig over tidsskalaer som er større enn tidsskalaen for objekter å bevege seg ut av dybdefeltet25,28. En grundigere drøfting av hvordan den q-avhengige dybdeskarpheten påvirker DDM-analysen finner du i22. For brightfield-avbildning kan det hende at brukerne også må vurdere prøvetykkelsen. Mens for svakt spredning av prøver kan tykkere prøver gi mer signal42, turbid prøver kan kreve endring av analysen for å gjøre rede for flere spredning81. Til slutt, for avbildningsmetoder som ikke er lineære rominvariante (det vil si hvor intensiteten som registreres av kameraet til et objekt, avhenger av hvor objektet er i x-y-prøveplanet), kan det hende man må ta hensyn til den lineære romvariasjonen, som vist med mørkt felt DDM27.
For de som kommer i gang med DDM, ønsker vi å understreke viktigheten av å vurdere den romlige og tidsmessige oppløsningen. Ved inspeksjon av de fastsatte forfallstidene som en funksjon av bølgenummer, er det viktig å markere grensene for ens oppløsning (dvs. maksimal og minimum oppholdstid og maksimalt bølgenummer, som gjort i figur 5). Man bør tenke nøye gjennom disse grensene før man samler inn data, slik at det optimale objektivet, bildestørrelsen, bildefrekvensen og filmvarigheten kan velges. Det andre viktige hensynet er hvordan du estimerer bakgrunnsparameteren B. Flere metoder for å estimere bakgrunnen er brukt i litteraturen, og effektene av over- eller underestimering av B er beskrevet i tidligere publikasjoner62,77. Som vist i figur 10, lar PyDDM brukere implementere forskjellige metoder for å estimere B, og vi foreslår at nye brukere prøver disse metodene og evaluerer hvilke som er hensiktsmessige å bruke.
En styrke for denne pakken er dens grundige dokumentasjon og gjennomganger med eksempeldata, lagring og organisering av metadata for å holde oversikt over hvordan analyser ble utført, og fleksibiliteten i hvordan man analyserer DDM-matrisen (ulike tilpasningsmodeller, flere metoder for å estimere bakgrunnsparameteren B, evnen til å finne MSD). Det er imidlertid flere aspekter ved denne koden som kan forbedres. Koden er for øyeblikket ikke optimalisert for rask beregningshastighet. Metoder for å fremskynde beregningen er rapportert61,62, og disse vil bli implementert i fremtidige utgivelser. I tillegg planlegger vi å implementere nylig rapporterte metoder for å bedre estimere usikkerheter og bruke simuleringer for å veilede brukere til riktig ISF-modell62. For andre forbedringer håper vi brukerne vil kontakte oss med forslag.
The authors have nothing to disclose.
Deler av denne forskningen ble finansiert av National Institutes of Health R15 Award (National Institute of General Medical Sciences award no. R15GM123420, tildelt R.M.R.-A. og R.J.M.), en Cottrell Scholar Award fra Research Corporation for Science Advancement (pris nr. 27459, tildelt R.J.M.), og en William M. Keck Foundation Research Grant (tildelt R.M.R-A.). GHK anerkjenner takknemlig økonomisk støtte fra Det nederlandske forskningsrådet (NWO; prosjektnummer VI.C.182.004 i NWO Talent Program).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |