Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM), dinamik ışık saçılması ve mikroskopi özelliklerini birleştirir. Burada, vimentin ağlarındaki parçacıkların subdifüzyon ve kafesli dinamiklerini ve aktif miyozin güdümlü aktin-mikrotübül kompozitlerinin balistik hareketini ölçerek yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarını karakterize etmek için DDM’yi kullanma süreci sunulmaktadır.
Hücreler sürünebilir, kendi kendini iyileştirebilir ve dikkat çekici derecede dinamik sitoiskeletleri nedeniyle sertliklerini ayarlayabilir. Bu nedenle, sitoiskelet biyopolimerlerinin ağlarının yeniden oluşturulması, bir dizi aktif ve uyarlanabilir malzemeye yol açabilir. Bununla birlikte, hassas bir şekilde ayarlanmış özelliklere sahip bu tür malzemelerin mühendisliği, dinamiklerin ağ bileşimine ve sentez yöntemlerine nasıl bağlı olduğunu ölçmeyi gerektirir. Bu tür dinamiklerin nicelleştirilmesi, kompozit ağların zaman, mekan ve formülasyon uzayı boyunca farklılıklarla karşı karşıya kalmaktadır. Buradaki protokol, Fourier analiz tekniğinin, diferansiyel dinamik mikroskopinin (DDM), biyopolimer ağlarının dinamiklerini nasıl ölçebildiğini ve özellikle sitoiskelet ağlarının çalışmaları için çok uygun olduğunu açıklamaktadır. DDM, lazer taramalı konfokal, geniş alan floresan ve parlak alan görüntüleme dahil olmak üzere bir dizi mikroskopi modalitesi kullanılarak elde edilen görüntülerin zaman dizileri üzerinde çalışır. Bu tür görüntü dizilerinden, dalga vektörlerinin bir aralığı boyunca yoğunluk dalgalanmalarının karakteristik korelasyon süreleri çıkarılabilir. DDM analizi yapmak için kullanıcı dostu, açık kaynaklı bir Python paketi de geliştirilmiştir. Bu paketle, burada ara filament (vimentin) ağları ve aktif aktin-mikrotübül ağlarının verileriyle gösterildiği gibi, etiketli sitoiskelet bileşenlerinin veya gömülü izleyici parçacıklarının dinamikleri ölçülebilir. Önceden programlama veya görüntü işleme deneyimi olmayan kullanıcılar, bu yazılım paketini ve ilgili belgeleri kullanarak DDM gerçekleştirebileceklerdir.
Hücre iskeleti, ökaryotik hücrelerin sitoplazması boyunca uzanan ve hücre yüzeyini çekirdeğe bağlayan bir protein filamentleri ağıdır. Büyük ve tekrarlanan mekanik yüklere karşı mekanik koruma sağlayan benzersiz malzeme özelliklerine sahiptir, ancak aynı zamanda dinamik hücre şekli değişikliklerini de yönlendirir1. Yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağları, gömülü parçacıkların kafeslenmesinden moleküler motorlar tarafından tahrik edilen balistik harekete kadar bir dizi ilginç dinamik davranışa yol açabilir 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Bu tür ağların dinamiklerini analiz etme yöntemleri arasında gömülü izleyici mikrosferlerinin hareketini izleme 6,7,12,13,14, zaman içinde protein yoğun kümelerin boyutunu izlemek için görüntü analizi8, dinamik ışık saçılması 15, parçacık görüntü velosimetrisi 4,16,17,18,19 , zaman içinde görüntülerin güç spektral yoğunluğunun hesaplanması19 ve kimograf analizi20. Yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağları üzerine daha fazla çalışma yapıldıkça, hücresel mekaniği veya aktif maddeyi anlamak için, dinamikleri karakterize etmek için sağlam, tarafsız ve tekrarlanabilir yöntemler giderek daha fazla gerekli hale gelmektedir. Diferansiyel dinamik mikroskopi (DDM) 21,22, sitoiskelet dinamiklerini incelemek için kullanılan nispeten yeni bir tekniktir, dinamikleri az sayıda kullanıcı tanımlı parametreyle verimli bir şekilde ölçen böyle bir tekniktir. Burada açıklanan yazılım paketiyle, programlama veya görüntü analizi konusunda çok az deneyime sahip araştırmacılar, DDM’yi kendi çalışmaları için kullanabileceklerdir.
DDM, bir numunenin dinamiklerini çıkarmak için kullanılan bir görüntü analiz tekniğidir. Parçacık izleme veya parçacık görüntü velosimetrisi gibi, DDM de tipik olarak mikroskopla kaydedilen bir dizi görüntü (genellikle binlerce görüntü) gerektirir. Parçacık izlemenin aksine, bireysel özelliklerin veya izleyici boncukların görüntüde yerelleştirilmesi (hatta yerelleştirilebilir) gerekmez. Hem partikül izleme hem de partikül görüntü velosimetrisinden farklı olarak, DDM ile topluluk dinamikleri nispeten az sayıda kullanıcı tarafından belirlenen parametrelerle kurtarılır. DDM ile görüntüler, bir dalga sayıları aralığı üzerindeki yoğunluk dalgalanmalarının bozunma süresini belirlemek için Fourier uzayında analiz edilir, q, burada q = 2πu ve u, uzamsal frekansların büyüklüğüdür. Biri saçılma benzeri bilgiler elde eder, ancak mikroskopta elde edilen gerçek uzay görüntüleriile 21,22,23. Bu nedenle, geniş alan floresan 22,24, konfokal floresan 25, polarize26, karanlık alan 27 veya ışık tabakası floresan 28 mikroskopi gibi çeşitli kontrast üretenmikroskopi yöntemlerinden yararlanılabilir. Ayrıca, DDM analizi için kullanılan görüntüler, tamamlayıcı bilgi sağlamak için partikül izleme veya partikül görüntü velosimetrisi için kullanılabilir.
Dinamik ışık saçılması ve optik mikroskopiden gelen özelliklerin bu kombinasyonu, DDM’yi güçlü ve çok yönlü bir teknik haline getirir. DDM’nin 73 nm kolloidal parçacıkların difüzyonunu ölçtüğü 2008 21’de Cerbino ve Trappe tarafından ilk tanımından bu yana, DDM, akan kolloidleriölçmek için kullanılmıştır 29, kolloidal agregasyon30,31, nematik sıvı kristallerin viskoelastisitesi26, kolloidal jellerin dinamikleri 32, kabalaştırıcı köpükler 33, sınırlı ortamlarda nanopartiküller 34, 35,36,37, bakteriyel hareketlilik 38,39,40,41, zayıf saçılan protein kümelerinin difüzyonu 42, sıvı arayüzlerinde kılcal dalgalar 43 ve diğer sistemler. DDM’yi kullanan yayınların daha eksiksiz bir listesini arayanlar, konuyla ilgili kapsamlı inceleme makalelerine başvurabilirler 22,23,44,45.
DDM, biyolojik ağların dinamiklerini araştırmak için de kullanılmıştır. Drechsler ve ark. canlı Drosophila oositlerinde aktinin dinamiklerini ölçmek için DDM’yi kullandılar46. Burla ve ark. hyaluronan ve hyaluronan-kollajen kompozitleri ağlarındaki izleyici parçacıkların dinamiklerini ölçmüştür47. DDM’nin yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarındaki izleyici parçacıkların dinamiklerini incelemek için çeşitli kullanımları9,10, bu tür ağlardaki DNA moleküllerinin taşınması48,49 ve aktif yeniden yapılandırılmış ağların dinamikleri de belgelenmiştir 11,50,51. DDM’nin bu tür sistemlerdeki dinamikleri ölçmedeki bir avantajı, bireysel parçacıkların veya moleküllerin lokalize edilmesine ve izlenmesine gerek olmamasıdır. Bu nedenle, örneğin, kalabalık ortamlardaki DNA moleküllerinin dinamikleri, bu kadar küçük ve küresel olmayan moleküllerin izlenmesindeki zorluğa rağmen DDM ile ölçülebilir. Ayrıca, floresan mikroskobu ile, karmaşık bir kompozitteki bireysel bileşenlerin dinamiklerini seçici olarak ölçmek için çok renkli etiketleme kullanılabilir.
DDM’yi gerçekleştirmek için, zaman içinde bir dizi görüntü alınır, I(x,y,t). Belirli bir gecikme süresi için, Δt, bu gecikme süresiyle ayrılmış tüm (veya bir alt kümesi) görüntü çiftleri bulunur. Her çiftin farkının kareli Fourier dönüşümü,
birlikte hesaplanır ve ortalaması alınır. Bu miktar, dinamiklerin izotropik olması koşuluyla radyal olarak ortalamadır. Bu, DDM matrisini (görüntü yapısı işlevi olarak da adlandırılır) verir
. Bu işlem Şekil 1’de grafiksel olarak gösterilmiştir. Bu DDM matrisinden numunenin dinamiklerini belirlemek için, DDM matrisinin formu aldığı varsayılır.
burada A, mikroskobun ayrıntılarına ve numunenin yapısına bağlı olan genliktir, B, görüntülerdeki gürültüye bağlı olan arka plandır ve f (q, Δt),dinamikler 21,22 hakkında bilgi içeren ara saçılma fonksiyonudur (ISF). Basit durumlarda,
burada τ karakteristik bir bozunma veya korelasyon süresidir. Böyle bir ISF, seyreltik kolloidal süspansiyonlar21,24,27,37,40,52 gibi ergodik sistemler üzerinde DDM kullanan çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bununla birlikte, ISF’nin diğer biçimleri çeşitli dinamik türlerini modellemek için kullanılabilir. Örneğin, polidispers numuneler için ISF’yi modellemek üzere kümülatif bir genişleme kullanılabilir.
burada μ polidispersitenin bir ölçüsüdür42,53; yoğunluk dalgalanmaları iki ayrı mod tarafından bozunursa, aşağıdaki gibi bir ISF kullanılabilir.
26, 54, 55, 56 , 57;
Diğer ISF’ler mikroorganizmaları veya diğer aktif parçacıklarıyüzdürmek için kullanılabilir 38,39,40,41,58,59.
Şekil 1: DDM analizine genel bakış. Görüntülerin zaman serilerinden, DDM matrisini hesaplamak için görüntü farklılıklarının Fourier dönüşümü hesaplanır. DDM matrisi, bir q değerleri aralığındaki yoğunluk dalgalanmalarının zaman ölçeğini belirlemek için bir modele sığdırılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada Python’da geliştirilen bir DDM analiz yazılım paketinin kullanımı, PyDDM, anlatılmaktadır. Bu yazılım paketi, araştırma laboratuvarlarımız tarafından yapılan çalışmalara ve son birkaç yılda yayınlanan diğer çalışmalara dayanmaktadır. Bu yazılım paketini oluşturmak için birincil motivasyon kaynakları arasında (1) analizde kullanılan meta verileri ve parametreleri takip etme ve depolama; (2) baştan sona ayrıntılı analiz örnekleri içeren kapsamlı dokümantasyon; ve (3) verileri sığdırmak için farklı matematiksel modeller kullanmanın (veya yeni) matematiksel modeller oluşturmanın kolay bir yolu (örneğin, aktif filamentler60 için yakın zamanda geliştirilenler gibi ISF modellerinin eklenmesi basit olacaktır). DDM analizi için diğer yazılım paketleri de mevcuttur, ancak hepsi iyi belgelenmemiş ve açık kaynaklı bir programlama dilinde yazılmamıştır. Örneğin, GPU’larda hesaplama ile C++ kodu (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, hesaplamaları hızlandırmak için zaman içinde Fourier dönüşümlerini kullanan C++ kodu (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB ve Python sürümleri (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB kodu (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 ve belirsizlik ölçümüne sahip MATLAB kodu ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Bu PyDDM paketi iyi belgelendiğinden ve DDM matrisinin nasıl hesaplandığı ve analiz edildiği konusunda çok fazla esneklik sağladığından, programlama veya görüntü analizindeki geçmişlerine bakılmaksızın DDM’yi uygulamak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir.
Protokol, bu yazılım paketinin in vitro yeniden yapılandırılmış sitoiskelet ağlarının dinamiklerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu, iki farklı görüntüleme verisi seti kullanılarak yapılır: (1) parlak alan mikroskobu ile alınan bir vimentin ağına gömülü mikron altı izleyici parçacıklarının görüntüleri ve (2) lazer taramalı konfokal mikroskopi ile alınan miyozin tahrikli aktiviteye sahip dolaşık bir kompozit ağdaki floresan etiketli aktin ve mikrotübül filamentlerinin görüntüleri. Bu iki veri kümesinin analizleri, çeşitli görüntüleme yöntemleriyle (örneğin, parlak alan veya konfokal floresan) çekilen görüntüleri analiz etme, gömülü izleyicilerden veya etiketli filamentlerden dinamikleri çıkarma ve çeşitli dinamikleri (örneğin, alt difüzyon ve kısıtlı veya balistik) ölçme yeteneği de dahil olmak üzere DDM’nin dikkate değer güçlü yönlerini vurgulamaktadır.
Burada açıklanan yazılım paketi, optik mikroskop kullanılarak elde edilen görüntülerde gözlenen yoğunluk dalgalanmalarını analiz etmek için DDM’yi kullanır. İlk olarak vimentin ağlarına gömülü izleyici parçacıkların verilerinden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. Bu tür verilerin analizi, ağın ağ boyutunu ve sertliğini, tek parçacık izlemenin sitoiskelet ağlarının geçmiş birçok çalışmasında nasıl kullanıldığına benzer şekilde karakterize etmek için kullanılabilir 6,12,13. DDM’yi tek parçacık izlemeye göre kullanmanın bir avantajı, DDM’nin parçacıkların lokalize edilmesini gerektirmemesidir. Bu nedenle, parçacık yoğunluğunun çok yüksek olduğu veya parçacıkların lokalize edilemeyecek ve izlenemeyecek kadar küçük olduğu görüntülerde bile, DDM dinamikleri belirleyebilir. Tek parçacık izlemenin avantajlı olacağı yer, parçacık-parçacık değişkenliğini incelerken. DDM ile, topluluk ortalama dinamikleri bulunurken, tek parçacık izleme ile hem tek bir parçacığın MSD’sini hem de topluluk ortalaması MSD’sini hesaplayabilir. Bununla birlikte, DDM, geniş bir görüş alanındaki birden fazla ilgi alanını analiz ederek heterojen dinamikleri araştırmak için kullanılabilir.
Daha sonra, iki farklı etiketli sitoiskelet filament tipinden oluşan aktif bir ağdaki floresan olarak etiketlenmiş filamentlerin verilerinden elde edilen temsili sonuçlar11 gösterilmiştir. Bu verilerle, balistik hareket, görüntü içinde herhangi bir yerelleştirilebilir özelliğe ihtiyaç duymadan karakterize edildi. DDM, topluluğun ortalama dinamiklerini az sayıda kullanıcı girdisiyle çıkardığından, farklı koşullarla elde edilen görüntü serilerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırır (örneğin; farklı aktin oranlarına sahip numunelerin mikrotübüllere veya50’de yapıldığı gibi farklı miyozin konsantrasyonlarına sahip numunelerin karşılaştırılması). Ek olarak, floresan görüntülemeyi kullanarak, çok renkli etiketleme kullanarak bir ağın farklı bileşenlerinin dinamiklerini araştırabiliriz. Bu, aktin ve mikrotübüllerin dinamiklerinin, çok renkli görüntüleme kullanılarak aktif bir aktin-mikrotübül kompozit ağında ayrı ayrı analiz edildiği 11,50’de yapıldı. Buradaki temsili sonuçlar bölümünde, sadece mikrotübül kanalından elde edilen sonuçlar gösterildi, ancak önceki çalışmalarda mikrotübül ve aktin filamentlerinin dinamiklerini karşılaştırdık11.
Bu temsili sonuçların ya pasif subdifüzyonu ya da aktif balistik hareketi sergilediğini not ediyoruz. Daha da önemlisi, DDM, ara zaman veya uzunluk ölçeklerinde dinamik tipinde bir geçişin olduğu sistemleri analiz etmek için kullanılabilir. Örnek olarak, Kurzthaler ve ark. DDM’yi kısa zaman ölçeklerinde aktif yönlendirilmiş hareketi ve daha uzun zaman ölçeklerinde oryantasyonun randomizasyonunu keşfetmek için aktif Janus kolloidleri sistemi ile birlikte kullanmışlardır59; Giavazzi ve ark. DDM’yi kaba bir köpükle kullandılar ve bir kabarcık33’ün uzunluk ölçeğine karşılık gelen dinamiklerde bir çapraz geçiş buldular; ve Cho ve ark. DDM’yi kolloidal jellerle kullandılar ve fraktal kümelerden tüm ağa kadar uzanan farklı uzunluk ölçeklerinde üç ayırt edilebilir rejim buldular32.
Temsili sonuçlar bölümünde yer alan veriler parlak alan mikroskobu ve lazer taramalı konfokal mikroskopi ile elde edilmiştir. Bununla birlikte, daha önce de belirtildiği gibi, DDM birçok görüntüleme yöntemiyle kullanılabilir. Herhangi bir görüntüleme yönteminde, kullanıcılar optik kesitleme derecesi veya alan derinliği gibi optik ayarları göz önünde bulundurmalıdır. Yüksek derecede optik bölümleme, odak dışı nesnelerden gelen sinyali azaltabilir, ancak nesnelerin alan derinliğinden25,28 dışına çıkması için zaman ölçeğinden daha büyük zaman ölçekleri üzerindeki dinamikleri doğru bir şekilde ölçemeyecektir. Q-bağımlı alan derinliğinin DDM analizini nasıl etkilediğine dair daha kapsamlı bir tartışma22’de bulunabilir. Parlak alan görüntüleme için, kullanıcıların numune kalınlığını da göz önünde bulundurmaları gerekebilir. Zayıf saçılan numuneler için, daha kalın numuneler daha fazla sinyalsağlayabilir 42, bulanık numuneler ise analizin birden fazla saçılma81’i hesaba katacak şekilde değiştirilmesini gerektirebilir. Son olarak, doğrusal uzay değişmezi olmayan görüntüleme yöntemleri için (yani, bir nesnenin kamerası tarafından kaydedilen yoğunluğun, o nesnenin x-y örnek düzleminde nerede olduğuna bağlı olduğu yerlerde), karanlık alan DDM27’de gösterildiği gibi doğrusal alan varyansının hesaba katılması gerekebilir.
DDM’ye başlayanlar için, mekansal ve zamansal çözünürlüğü göz önünde bulundurmanın önemini vurgulamak istiyoruz. Belirlenen bozunma sürelerini dalga sayısının bir fonksiyonu olarak incelerken, kişinin çözünürlüğünün sınırlarını işaretlemek önemlidir (yani, Şekil 5’te yapıldığı gibi, maksimum ve minimum gecikme süreleri ve maksimum dalga sayısı). Veri toplamadan önce bu sınırlar hakkında dikkatlice düşünülmelidir, böylece en uygun objektif lens, görüntü boyutu, kare hızı ve film süresi seçilebilir. Diğer önemli husus, arka plan parametresi B’nin nasıl tahmin edileceğidir. Literatürde arka planı tahmin etmek için birçok yöntem kullanılmış ve B’yi fazla veya küçümsemenin etkileri önceki yayınlarda 62,77’de tanımlanmıştır. Şekil 10’da gösterildiği gibi, PyDDM, kullanıcıların B’yi tahmin etmek için farklı yöntemler uygulamalarına izin verir ve yeni kullanıcıların bu yöntemleri denemelerini ve hangilerinin kullanımına uygun olduğunu değerlendirmelerini öneririz.
Bu paketin güçlü bir gücü, örnek verileri içeren kapsamlı dokümantasyonu ve izlenecek yolları, analizlerin nasıl gerçekleştirildiğini takip etmek için meta verilerin depolanması ve düzenlenmesi ve DDM matrisinin nasıl analiz edileceği esnekliğidir (çeşitli montaj modelleri, arka plan parametresi B’yi tahmin etmek için birden fazla yöntem, MSD’yi bulma yeteneği). Ancak, bu kodun geliştirilebilecek birçok yönü vardır. Şu anda, kod hızlı hesaplama hızı için optimize edilmemiştir. Hesaplamayı hızlandırma yöntemleri61,62 olarak bildirilmiştir ve bunlar gelecekteki sürümlerde uygulanacaktır. Ek olarak, belirsizlikleri daha iyi tahmin etmek ve kullanıcıları uygun ISF modeli62’ye yönlendirmek için simülasyonlar kullanmak için yakın zamanda bildirilen yöntemleri uygulamayı planlıyoruz. Diğer iyileştirmeler için, kullanıcıların önerileriyle bizimle iletişime geçeceğini umuyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırmanın bazı bölümleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri R15 Ödülü (Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü ödül no. R15GM123420, R.M.R.-A.’ya verildi. ve R.J.M.), Research Corporation for Science Advancement’tan bir Cottrell Scholar Ödülü (ödül no. 27459, R.J.M.’ye verilir) ve William M. Keck Vakfı Araştırma Bursu (R.M.R-A.’ya verilir). GHK, Hollanda Araştırma Konseyi’nin (NWO; NWO Yetenek Programı’nın VI.C.182.004 proje numarası) mali desteğini minnetle kabul eder.
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |