La microscopie dynamique différentielle (DDM) combine les caractéristiques de la diffusion dynamique de la lumière et de la microscopie. Ici, le processus d’utilisation du DDM pour caractériser les réseaux de cytosquelettes reconstitués en quantifiant la dynamique sous-diffusive et en cage des particules dans les réseaux de vimentine et le mouvement balistique des composites actifs actine-microtubules entraînés par la myosine est présenté.
Les cellules peuvent ramper, s’auto-guérir et régler leur raideur en raison de leur cytosquelette remarquablement dynamique. En tant que tel, la reconstitution de réseaux de biopolymères cytosquelettiques peut conduire à une foule de matériaux actifs et adaptables. Cependant, l’ingénierie de tels matériaux avec des propriétés précisément réglées nécessite de mesurer comment la dynamique dépend de la composition du réseau et des méthodes de synthèse. La quantification de cette dynamique est remise en question par les variations dans le temps, l’espace et l’espace de formulation des réseaux composites. Le protocole décrit ici comment la technique d’analyse de Fourier, la microscopie dynamique différentielle (DDM), peut quantifier la dynamique des réseaux de biopolymères et est particulièrement bien adaptée aux études des réseaux de cytosquelettes. DDM travaille sur des séquences temporelles d’images acquises à l’aide d’une gamme de modalités de microscopie, y compris l’imagerie confocale à balayage laser, la fluorescence à grand champ et l’imagerie en champ clair. À partir de telles séquences d’images, on peut extraire des temps de décorrélation caractéristiques des fluctuations de densité sur une gamme de vecteurs d’onde. Un package Python open source convivial pour effectuer une analyse DDM est également développé. Avec ce paquet, on peut mesurer la dynamique des composants marqués du cytosquelette ou des particules traceuses incorporées, comme démontré ici avec les données des réseaux de filaments intermédiaires (vimentine) et des réseaux actifs actine-microtubules. Les utilisateurs n’ayant aucune expérience préalable de la programmation ou du traitement d’images seront en mesure d’effectuer DDM à l’aide de ce progiciel et de la documentation associée.
Le cytosquelette est un réseau de filaments protéiques qui s’étend à travers le cytoplasme des cellules eucaryotes, reliant la surface cellulaire au noyau. Il possède des propriétés matérielles uniques, offrant une protection mécanique contre les charges mécaniques importantes et répétées, tout en entraînant des changements dynamiques de forme de cellule1. Les réseaux de cytosquelettes reconstitués peuvent donner lieu à une gamme de comportements dynamiques intéressants, allant de la mise en cage de particules incorporées au mouvement balistique entraîné par des moteurs moléculaires 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Les méthodes d’analyse de la dynamique de ces réseaux comprennent le suivi du mouvement des microsphères traceuses intégrées 6,7,12,13,14, l’analyse d’images pour suivre la taille des amas denses en protéines au fil du temps 8, la diffusion dynamique de la lumière15, la vélocimétrie d’image de particules 4,16,17,18,19 , calcul de la densité spectrale de puissance des images au fil du temps19 et analyse kymographique20. Au fur et à mesure que de plus en plus d’études sur les réseaux de cytosquelettes reconstitués sont menées, que ce soit pour comprendre la mécanique cellulaire ou la matière active, des méthodes robustes, impartiales et reproductibles pour caractériser la dynamique sont de plus en plus nécessaires. La microscopie dynamique différentielle (DDM)21,22, une technique relativement nouvelle qui a été utilisée pour étudier la dynamique du cytosquelette, est l’une de ces techniques qui quantifie efficacement la dynamique avec peu de paramètres définis par l’utilisateur. Avec le progiciel décrit ici, les chercheurs ayant peu d’expérience en programmation ou en analyse d’images pourront tirer parti de DDM pour leur propre travail.
DDM est une technique d’analyse d’image permettant d’extraire la dynamique d’un échantillon. Comme le suivi des particules ou la vélocimétrie d’images de particules, DDM nécessite une série chronologique d’images (souvent des milliers d’images), généralement enregistrées au microscope. Contrairement au suivi des particules, les caractéristiques individuelles ou les billes traceuses n’ont pas besoin d’être localisées (ni même localisables) dans l’image. Contrairement au suivi des particules et à la vélocimétrie d’image des particules, on récupère la dynamique d’ensemble avec DDM avec relativement peu de paramètres spécifiés par l’utilisateur. Avec DDM, les images sont analysées dans l’espace de Fourier pour déterminer le temps de désintégration des fluctuations de densité sur une gamme de nombres d’ondes, q, où q = 2πu, et u est la magnitude des fréquences spatiales, . On obtient des informations de type diffusion mais avec des images de l’espace réel acquises au microscope 21,22,23. Par conséquent, on peut tirer parti des différentes méthodes de microscopie génératrices de contraste, telles que la fluorescence à grand champ22,24, la fluorescence confocale25, la polarisation26, le champ sombre27 ou la fluorescence à feuille de lumière28. En outre, les images utilisées pour l’analyse DDM peuvent être utilisées pour le suivi des particules ou la vélocimétrie d’images de particules afin de fournir des informations complémentaires.
Cette combinaison de caractéristiques de diffusion dynamique de la lumière et de microscopie optique fait du DDM une technique puissante et polyvalente. Depuis sa première description par Cerbino et Trappe en 200821, où il a été démontré que le DDM mesure la diffusion de particules colloïdales de 73 nm, le DDM a été utilisé pour mesurer les colloïdesen écoulement 29, l’agrégation colloïdale 30,31, la viscoélasticité des cristaux liquides nématiques26, la dynamique des gels colloïdaux32, les mousses grossissantes33, les nanoparticules dans des environnements confinés 34, 35,36,37, la motilité bactérienne 38,39,40,41, la diffusion d’amas de protéines faiblement diffusants 42, les ondes capillaires aux interfaces fluides43 et d’autres systèmes. Ceux qui recherchent une liste plus complète des publications utilisant DDM peuvent se référer à des articles de synthèse approfondis sur le sujet 22,23,44,45.
Le DDM a également été utilisé pour étudier la dynamique des réseaux biologiques. Drechsler et al. ont utilisé le DDM pour mesurer la dynamique de l’actine dans les ovocytes vivants de la drosophile 46. Burla et al. ont quantifié la dynamique des particules traceuses dans les réseaux de composites hyaluronane et hyaluronane-collagène47. Plusieurs utilisations du DDM pour étudier la dynamique des particules traceuses dans les réseaux de cytosquelettes reconstitués 9,10, le transport des molécules d’ADN dans de tels réseaux 48,49 et la dynamique des réseaux actifs reconstitués ont également été documentées 11,50,51. Un avantage du DDM dans la mesure de la dynamique dans de tels systèmes est que les particules ou molécules individuelles n’ont pas besoin d’être localisées et suivies. Ainsi, par exemple, la dynamique des molécules d’ADN dans des environnements surpeuplés peut être mesurée avec DDM malgré la difficulté de suivre ces molécules petites et non sphériques. De plus, avec la microscopie à fluorescence, on peut utiliser l’étiquetage multicolore pour mesurer sélectivement la dynamique des constituants individuels dans un composite complexe.
Pour effectuer DDM, une séquence d’images est prise au fil du temps, I(x,y,t). Pour un temps de latence donné, Δt, toutes les paires d’images séparées par ce temps de décalage (ou un sous-ensemble de) sont trouvées. La transformée de Fourier au carré de la différence de chaque paire,
est calculé et moyenné ensemble. Cette quantité, , est moyenne radiale, à condition que la dynamique soit isotrope. Cela donne la matrice DDM (également appelée fonction de structure d’image),
. Ce processus est illustré graphiquement à la figure 1. Pour déterminer la dynamique de l’échantillon à partir de cette matrice DDM, la matrice DDM est supposée prendre la forme
où A est l’amplitude, qui dépend des détails du microscope et de la structure de l’échantillon, B est l’arrière-plan, qui dépend du bruit dans les images, et f (q, Δt) est la fonction de diffusion intermédiaire (ISF), qui contient des informations sur la dynamique21,22. Dans des cas simples,
où τ est un temps de désintégration ou de décorrélation caractéristique. Un tel FSI a été utilisé dans plusieurs études utilisant le DDM sur des systèmes ergodiques tels que les suspensions colloïdales diluées 21,24,27,37,40,52. Cependant, d’autres formes de l’ISF peuvent être utilisées pour modéliser divers types de dynamique. Par exemple, on peut utiliser une expansion de cumulant pour modéliser l’ISF pour les échantillons polydispersés comme suit :
où μ est une mesure de la polydispersité42,53; si les fluctuations de densité se désintègrent par deux modes distincts, on peut utiliser un ISF comme
26, 54, 55, 56, 57;
d’autres FSI peuvent être utilisés pour nager des micro-organismes ou d’autres particules actives 38,39,40,41,58,59.
Figure 1 : Vue d’ensemble de l’analyse DDM. À partir de la série chronologique d’images, la transformée de Fourier des différences d’image est calculée pour calculer la matrice DDM. La matrice DDM peut être adaptée à un modèle pour déterminer l’échelle de temps des fluctuations de densité sur une plage de valeurs q. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ici, l’utilisation d’un progiciel d’analyse DDM développé en Python, PyDDM, est décrite. Ce progiciel s’appuie sur le travail effectué par nos laboratoires de recherche et d’autres études publiées au cours des dernières années. Les principales motivations pour la création de ce progiciel comprennent la nécessité de (1) garder une trace et de stocker les métadonnées et les paramètres utilisés dans l’analyse; (2) une documentation complète avec des exemples détaillés d’analyse du début à la fin; et (3) un moyen facile d’utiliser différents modèles mathématiques (ou d’en créer de nouveaux) pour ajuster les données (par exemple, l’ajout de modèles ISF, tels que ceux récemment développés pour les filaments actifs60, serait simple). D’autres progiciels pour l’analyse DDM existent également, bien que tous ne soient pas bien documentés et écrits dans un langage de programmation open source. Par exemple, il existe du code C++ avec calcul sur GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, du code C++ qui utilise des transformations de Fourier dans le temps pour accélérer les calculs (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, des versions MATLAB et Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, du code MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 et du code MATLAB avec quantification de l’incertitude ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Comme ce package PyDDM est bien documenté et offre beaucoup de flexibilité dans la façon dont la matrice DDM est calculée et analysée, il peut, espérons-le, être utile aux chercheurs qui cherchent à mettre en œuvre DDM indépendamment de leur expérience en programmation ou en analyse d’images.
Le protocole montre comment ce progiciel peut être utilisé pour quantifier la dynamique des réseaux de cytosquelettes reconstitués in vitro . Cela se fait en utilisant deux ensembles distincts de données d’imagerie: (1) des images de particules traceuses submicroniques intégrées dans un réseau de vimentine prises avec la microscopie à fond clair et (2) des images de filaments d’actine et de microtubules marqués par fluorescence dans un réseau composite intriqué avec une activité induite par la myosine prises avec la microscopie confocale à balayage laser. Les analyses de ces deux ensembles de données mettent en évidence les points forts notables du DDM, y compris sa capacité à analyser des images prises avec une variété de modalités d’imagerie (p. ex., fluorescence en champ clair ou confocale), à extraire la dynamique des traceurs intégrés ou des filaments marqués, et à quantifier une variété de dynamiques (p. ex., subdiffusives et contraintes ou balistiques).
Le progiciel décrit ici utilise DDM pour analyser les fluctuations de densité observées dans les images acquises à l’aide d’un microscope optique. Des résultats représentatifs des données des particules traceuses incorporées dans les réseaux de vimentine ont d’abord été montrés. L’analyse de ces données peut être utilisée pour caractériser la taille du maillage et la rigidité du réseau de la même manière que le suivi des particules uniques a été utilisé dans de nombreuses études antérieures sur les réseaux de cytosquelettes 6,12,13. Un avantage de l’utilisation de DDM par rapport au suivi d’une seule particule est que DDM ne nécessite pas que les particules soient localisées. Par conséquent, même dans les images où la densité de particules est trop élevée ou les particules trop petites pour être localisées et suivies, DDM peut toujours déterminer la dynamique. Là où le suivi d’une seule particule serait avantageux, c’est lors de l’inspection de la variabilité d’une particule à l’autre. Avec DDM, on trouve la dynamique moyenne de l’ensemble alors que, avec le suivi d’une seule particule, on peut calculer à la fois le MSD d’une seule particule et le MSD moyenné de l’ensemble. Cependant, DDM peut être utilisé pour étudier la dynamique hétérogène en analysant plusieurs régions d’intérêt dans un large champ de vision.
Ensuite, des résultats représentatifs des données de filaments marqués par fluorescence dans un réseau actif composé de deux types de filaments cytosquelettiques marqués différemment ont été montrés11. Avec ces données, le mouvement balistique a été caractérisé sans avoir besoin de caractéristiques localisables dans l’image. Étant donné que DDM extrait la dynamique moyenne de l’ensemble avec peu d’entrées de l’utilisateur, il facilite la comparaison des séries d’images acquises avec différentes conditions (par exemple, en comparant des échantillons avec différents rapports d’actine à microtubules ou des échantillons avec différentes concentrations de myosine, comme cela a été fait dans50). De plus, en utilisant l’imagerie fluorescente, nous pouvons étudier la dynamique de différents composants d’un réseau en utilisant l’étiquetage multicolore. Cela a été fait dans11,50, où la dynamique de l’actine et des microtubules a été analysée séparément dans un réseau composite actif actine-microtubule à l’aide d’une imagerie multicolore. Dans la section des résultats représentatifs ici, seuls les résultats du canal microtubule ont été montrés, mais dans des travaux précédents, nous avons comparé la dynamique des filaments de microtubule et d’actine11.
Nous notons que ces résultats représentatifs présentent soit une sous-diffusion passive, soit un mouvement balistique actif. Il est important de noter que DDM peut être utilisé pour analyser les systèmes où il existe un croisement dans le type de dynamique à des échelles de temps ou de longueur intermédiaires. À titre d’exemples, Kurzthaler et coll. ont utilisé le DDM avec un système de colloïdes Janus actifs pour explorer le mouvement dirigé actif à de courtes échelles de temps et la randomisation de l’orientation à des échelles de temps plus longues59; Giavazzi et al. ont utilisé DDM avec une mousse grossissante et ont trouvé un croisement dans la dynamique correspondant à l’échelle de longueur d’une bulle33; et Cho et coll. ont utilisé le DDM avec des gels colloïdaux et ont trouvé trois régimes distincts à différentes échelles de longueur allant des amas fractaux à l’ensemble du réseau32.
Les données incluses dans la section des résultats représentatifs ont été acquises avec la microscopie à fond clair et la microscopie confocale à balayage laser. Cependant, comme indiqué précédemment, DDM peut être utilisé avec de nombreuses modalités d’imagerie. Avec n’importe quelle modalité d’imagerie, les utilisateurs doivent tenir compte des paramètres optiques tels que le degré de section optique ou la profondeur de champ. Un degré élevé de sectionnement optique peut réduire le signal provenant d’objets flous, mais on ne sera pas en mesure de mesurer avec précision la dynamique sur des échelles de temps supérieures à l’échelle de temps pour que les objets sortent de la profondeur de champ25,28. Une discussion plus approfondie sur la façon dont la profondeur de champ dépendante de q affecte l’analyse DDM peut être trouvée dans22. Pour l’imagerie en champ clair, les utilisateurs peuvent également avoir besoin de prendre en compte l’épaisseur de l’échantillon. Alors que pour les échantillons à faible diffusion, les échantillons plus épais peuvent fournir plus de signal42, les échantillons troubles peuvent nécessiter une modification de l’analyse pour tenir compte de la diffusion multiple81. Enfin, pour les méthodes d’imagerie qui ne sont pas invariantes linéaires de l’espace (c’est-à-dire où l’intensité enregistrée par la caméra d’un objet dépend de l’endroit où cet objet se trouve dans le plan d’échantillonnage x-y), il peut être nécessaire de tenir compte de la variance linéaire de l’espace, comme démontré avec le DDM27 en champ sombre.
Pour ceux qui commencent avec DDM, nous souhaitons souligner l’importance de prendre en compte la résolution spatiale et temporelle. Lors de l’inspection des temps de désintégration déterminés en fonction du nombre d’onde, il est important de marquer les limites de la résolution (c.-à-d. les temps de latence maximum et minimum et le nombre d’onde maximal, comme le fait la figure 5). Il faut bien réfléchir à ces limites avant de collecter des données afin de sélectionner l’objectif optimal, la taille de l’image, la fréquence d’images et la durée du film. L’autre considération importante est de savoir comment estimer le paramètre d’arrière-plan B. De multiples méthodes d’estimation du contexte ont été utilisées dans la littérature, et les effets de la surestimation ou de la sous-estimation de B ont été décrits dans des publications antérieures62,77. Comme le montre la figure 10, PyDDM permet aux utilisateurs d’implémenter différentes méthodes pour estimer B, et nous suggérons aux nouveaux utilisateurs d’essayer ces méthodes et d’évaluer celles qui sont appropriées à utiliser.
L’une des forces de ce package est sa documentation complète et ses procédures pas à pas comprenant des exemples de données, le stockage et l’organisation des métadonnées pour suivre la façon dont les analyses ont été effectuées, et la flexibilité dans la façon d’analyser la matrice DDM (divers modèles d’ajustement, plusieurs méthodes pour estimer le paramètre d’arrière-plan B, la possibilité de trouver le MSD). Cependant, il y a plusieurs aspects de ce code qui pourraient être améliorés. Actuellement, le code n’a pas été optimisé pour une vitesse de calcul rapide. Les méthodes d’accélération du calcul ont été signalées61,62, et celles-ci seront mises en œuvre dans les versions futures. De plus, nous prévoyons de mettre en œuvre des méthodes récemment signalées pour mieux estimer les incertitudes et d’utiliser des simulations pour guider les utilisateurs vers le modèle62 approprié du FSI. Pour d’autres améliorations, nous espérons que les utilisateurs nous contacteront avec des suggestions.
The authors have nothing to disclose.
Certaines parties de cette recherche ont été financées par un prix R15 des National Institutes of Health (prix no. R15GM123420, attribué à R.M.R.-A. et R.J.M.), un Cottrell Scholar Award de la Research Corporation for Science Advancement (prix no 27459, décerné à R.J.M.), et une william M. Keck Foundation Research Grant (décernée à R.M.R-A.). GHK remercie le Conseil néerlandais de la recherche (NWO; numéro de projet VI.C.182.004 du programme NWO Talent).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |