差分动态显微镜(DDM)结合了动态光散射和显微镜的特征。本文介绍了利用DDM通过量化维门汀网络中颗粒的亚扩散和笼中动力学以及活性肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动来表征重构细胞骨架网络的过程。
细胞可以爬行,自愈,并由于其显着的动态细胞骨架而调整其僵硬。因此,重构细胞骨架生物聚合物网络可能导致许多活性和适应性强的材料。然而,设计具有精确调谐特性的此类材料需要测量动力学如何依赖于网络组成和合成方法。量化这种动态受到复合网络在时间、空间和公式空间变化方面的挑战。此处的协议描述了傅里叶分析技术,即微分动态显微镜(DDM),如何量化生物聚合物网络的动力学,并且特别适合于细胞骨架网络的研究。DDM适用于使用一系列显微镜模式(包括激光扫描共聚焦,宽视场荧光和明场成像)获取的图像的时间序列。从这样的图像序列中,可以提取波矢量跨度内密度波动的特征去相关时间。还开发了一个用户友好的开源Python包来执行DDM分析。使用该软件包,可以测量标记的细胞骨架组分或嵌入的示踪颗粒的动力学,如中间丝(vimentin)网络和活性肌动蛋白 – 微管网络的数据所示。没有编程或图像处理经验的用户将能够使用此软件包和相关文档执行DDM。
细胞骨架是一个蛋白质细丝网络,横跨真核细胞的细胞质,将细胞表面连接到细胞核。它具有独特的材料特性,可针对大而重复的机械负载提供机械保护,同时还能驱动动态单元形状变化1.重构的细胞骨架网络可以产生一系列有趣的动态行为,从嵌入粒子的笼子到分子马达驱动的弹道运动2,3,4,5,6,7,8,9,10,11.分析此类网络的动力学的方法包括跟踪嵌入的示踪微球6,7,12,13,14的运动,图像分析以跟踪蛋白质致密簇的大小随时间的变化8,动态光散射15,粒子图像测速4,16,17,18,19,计算图像在一段时间内的功率谱密度19,并分析KUKIR图20。随着对重构细胞骨架网络的更多研究的进行,无论是了解细胞力学还是活性物质,越来越需要稳健,无偏倚和可重复的动力学表征方法。差分动态显微镜(DDM)21,22是一种相对较新的技术,已被用于研究细胞骨架动力学,是一种用很少的用户定义参数有效量化动力学的技术。使用这里描述的软件包,在编程或图像分析方面经验很少的研究人员将能够利用DDM进行自己的工作。
DDM是一种图像分析技术,用于提取样品的动力学。与粒子跟踪或粒子图像测速一样,DDM需要图像的时间序列(通常为数千张图像),通常用显微镜记录。与粒子跟踪不同,单个特征或示踪剂磁珠不需要在图像中定位(甚至可定位)。与粒子跟踪和粒子图像测速不同,使用DDM恢复融合动力学,用户指定的参数相对较少。使用DDM,在傅里叶空间中分析图像,以确定密度波动在波数范围q(其中q = 2πu)和u是空间频率的大小。一个获得类似散射的信息,但在显微镜21,22,23上获取真实空间图像。因此,可以利用显微镜的各种造影方法,例如宽视场荧光22,24,共聚焦荧光25,偏振26,暗场27或光片荧光28显微镜。此外,用于DDM分析的图像可用于粒子跟踪或粒子图像测速,以提供补充信息。
动态光散射和光学显微镜的这种功能组合使DDM成为一种功能强大且用途广泛的技术。自 Cerbino 和 Trappe 在 2008年首次描述以来,其中 DDM 被证明可以测量 73 nm 胶体颗粒的扩散,DDM 已被用于测量流动胶体29、胶体聚集30、31、向列状液晶26 的粘弹性、胶体凝胶32 的动力学、粗化泡沫33、受限环境中的纳米颗粒34、35、36、37、细菌运动38、39、40、41、弱散射蛋白簇的扩散42、流体界面处的毛细管波43、以及其他系统。那些寻找更完整的使用DDM的出版物列表的人可以参考有关主题22,23,44,45的全面审查论文。
DDM也被用于研究生物网络的动力学。德雷克斯勒等人使用DDM测量活 果蝇 卵母细胞中肌动蛋白的动力学46。Burla等人量化了透明质酸和透明质酸-胶原复合材料网络中示踪颗粒的动力学47。DDM的几个用途用于研究重组细胞骨架网络9,10中示踪粒子的动力学,此类网络48,49中DNA分子的运输以及活性重组网络的动力学11,50,51。DDM在测量此类系统中的动力学方面的一个优点是不需要定位和跟踪单个颗粒或分子。因此,例如,尽管难以追踪这种小分子和非球形分子,但可以使用DDM测量拥挤环境中DNA分子的动力学。此外,通过荧光显微镜,可以使用多色标记来选择性地测量复杂复合材料中单个成分的动力学。
要执行 DDM,需要随时间 I(x,y,t) 拍摄一系列图像。对于给定的滞后时间 Δt,可以找到由该滞后时间分隔的所有(或一部分)图像对。每对差的平方傅里叶变换,
一起计算和平均。这个量是 径向平均的,前提是动力学是各向同性的。这将生成 DDM 矩阵(也称为图像结构函数)
。此过程如图 1 所示。为了从此 DDM 矩阵中确定样本的动态,假定 DDM 矩阵采用以下形式:
其中 A 是振幅,取决于显微镜的细节和样品的结构, B 是背景,这取决于图像中的噪声, f(q,Δt)是中间散射函数(ISF),它包含有关动力学21,22的信息。在简单的情况下,
其中 τ 是特征衰减或去相关时间。这种ISF已被用于在热转系统上使用DDM的几项研究中,例如稀释胶体悬浮液21,24,27,37,40,52。但是,其他形式的 ISF 可用于对各种类型的动力学进行建模。例如,可以使用累积膨胀将多分散样品的 ISF 建模为
其中μ 是多分散度42,53的量度;如果密度波动衰减了两种不同的模式,则可以使用ISF,如
票价:26、 54、 55、 56、 57;
其它ISF可用于游动微生物或其它活性颗粒38、39、40、41、58、59。
图 1:DDM 分析概述。 根据图像的时间序列,计算图像差异的傅里叶变换以计算DDM矩阵。DDM 矩阵可以拟合到模型中,以确定 q 值范围内密度波动的时间尺度。 请点击此处查看此图的大图。
在这里,描述了使用在Python中开发的DDM分析软件包,PyDDM。该软件包建立在我们的研究实验室和其他已发表的研究在过去几年中所做的工作之上。创建此软件包的主要动机包括需要(1)跟踪和存储分析中使用的元数据和参数;(2)从头到尾进行详细的分析,并附上详细的分析实例;(3)一种使用不同(或创建新的)数学模型来拟合数据的简单方法(例如,添加ISF模型,例如最近为有源细丝60开发的模型,将很简单)。其他用于DDM分析的软件包也存在,尽管并非所有软件包都有很好的文档记录并以开源编程语言编写。例如,在 GPU 上计算的代码C++ (https://github.com/peterlu/ConDDM)25、C++使用傅里叶变换来加快计算速度的代码(https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61、MATLAB 和 Python 版本 (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40、MATLAB 代码 (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 以及具有不确定性量化的 MATLAB 代码(https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62.由于这个PyDDM包有很好的文档记录,并且在如何计算和分析DDM矩阵方面提供了很大的灵活性,因此无论其编程或图像分析背景如何,它都有望对希望实现DDM的研究人员有用。
该协议显示了如何使用该软件包来量化 体外 重构细胞骨架网络的动力学。这是通过使用两组不同的成像数据来完成的:(1)用明场显微镜拍摄的嵌入在vimentin网络中的亚微米示踪颗粒的图像,以及(2)用激光扫描共聚焦显微镜拍摄的具有肌球蛋白驱动活性的纠缠复合网络中荧光标记的肌动蛋白和微管丝的图像。对这两个数据集的分析突出了DDM的显着优势,包括它能够分析使用各种成像方式(例如,明场或共聚焦荧光)拍摄的图像,从嵌入式示踪剂或标记的细丝中提取动力学,以及量化各种动力学(例如,下扩散和约束或弹道)。
这里描述的软件包使用DDM来分析使用光学显微镜获取的图像中观察到的密度波动。首先显示嵌入在维门汀网络中的示踪颗粒数据的代表性结果。对这些数据的分析可用于表征网络的网格大小和刚度,类似于过去许多细胞骨架网络6,12,13研究中使用单粒子跟踪的方式。与单粒子跟踪相比,使用DDM的一个优点是DDM不需要对粒子进行定位。因此,即使在粒子密度太高或粒子太小而无法定位和跟踪的图像中,DDM仍然可以确定动态。单粒子跟踪在检查粒子间变异性时是有利的。使用DDM,可以找到集合平均动力学,而使用单粒子跟踪,可以计算单个粒子的MSD和集合平均MSD。然而,DDM可用于通过分析大视野内的多个感兴趣区域来研究异构动力学。
接下来,显示了由两种不同标记的细胞骨架丝类型组成的活性网络中荧光标记的细丝数据的代表性结果11。有了这些数据,弹道运动就被表征了,而不需要图像中任何可定位的特征。由于DDM以很少的用户输入提取融合平均动力学,因此它使得比较在不同条件下获得的图像序列变得简单(例如,比较具有不同肌动蛋白与微管比率的样品或具有不同浓度肌球蛋白的样品,如50所示)。此外,使用荧光成像,我们可以使用多色标记来研究网络不同组分的动力学。这是在11,50中完成的,其中使用多色成像在活性肌动蛋白 – 微管复合网络中分别分析肌动蛋白和微管的动力学。在这里的代表性结果部分中,仅显示了微管通道的结果,但在以前的工作中,我们比较了微管和肌动蛋白丝11的动力学。
我们注意到,这些具有代表性的结果显示了被动俯冲或主动弹道运动。重要的是,DDM可用于分析在中间时间或长度尺度上动力学类型存在交叉的系统。例如,Kurzthaler等人使用DDM和活性Janus胶体系统来探索短时间尺度上的主动定向运动和较长时间尺度59处方向的随机化;Giavazzi等人将DDM与粗糙的泡沫一起使用,并在对应于气泡33的长度尺度的动力学中发现了交叉;Cho等人将DDM与胶体凝胶一起使用,并发现了从分形簇到整个网络32的不同长度尺度上的三种可区分的方案。
代表性结果部分包含的数据是用明场显微镜和激光扫描共聚焦显微镜获取的。然而,如前所述,DDM可以与许多成像方式一起使用。对于任何成像方式,用户都应考虑光学设置,例如光学切片程度或景深。高度的光学切片可能会减少来自失焦物体的信号,但人们将无法在大于物体移出景深25,28的时间尺度上精确测量动态。关于 q相关景深如何影响DDM分析的更全面讨论可以在22中找到。对于明场成像,用户可能还需要考虑样品厚度。而对于弱散射样品,较厚的样品可以提供更多的信号42,而浑浊的样品可能需要修改分析以考虑多重散射81。最后,对于非线性空间不变的成像方法(即,物体的相机记录的强度取决于该物体在 x-y 样品平面中的位置),可能需要考虑线性空间方差,如暗场DDM27所示。
对于那些开始使用DDM的人来说,我们希望强调考虑空间和时间分辨率的重要性。当将确定的衰减时间作为波数的函数进行检查时,重要的是要标记分辨率的极限(即最大和最小滞后时间以及最数,如图5所示)。在收集数据之前,应仔细考虑这些限制,以便选择最佳的物镜、图像尺寸、帧速率和短片持续时间。另一个重要的考虑因素是如何估计背景参数 B。文献中已经使用了多种估计背景的方法,并且在先前的出版物62,77中已经描述了过度或低估B的影响。如图 10 所示,PyDDM 允许用户实现不同的 B 估计方法,我们建议新用户尝试这些方法并评估哪些方法适合使用。
该软件包的优势在于其全面的文档和演练,其中包含示例数据,元数据的存储和组织以跟踪分析的执行方式,以及如何分析DDM矩阵的灵活性(各种拟合模型,用于估计背景参数 B的多种方法,查找MSD的能力)。但是,此代码有多个方面可以改进。目前,代码尚未针对快速计算速度进行优化。加速计算的方法已经报告了61,62,这些方法将在未来的版本中实施。此外,我们计划实施最近报告的方法,以更好地估计不确定性,并采用模拟来引导用户使用适当的ISF模型62。对于其他改进,我们希望用户能够与我们联系并提供建议。
The authors have nothing to disclose.
这项研究的部分内容由美国国立卫生研究院R15奖资助(国家普通医学科学研究所奖号)。R15GM123420,授予美国皇家海军陆战队和R.J.M.),来自科学促进研究公司的科特雷尔学者奖(第27459号,授予R.J.M.)和威廉M.凯克基金会研究补助金(授予R.M.R-A.)。GHK非常感谢荷兰研究理事会的财政支持(NWO,NWO人才计划项目编号VI.C.182.004)。
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
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Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
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Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |