A microscopia dinâmica diferencial (DDM) combina características de dispersão dinâmica de luz e microscopia. Aqui, é apresentado o processo de utilização do DDM para caracterizar redes de citoesqueleto reconstituídas quantificando a dinâmica subdiffusiva e enjaulada de partículas em redes de vimentina e o movimento balístico de compostos ativos de actin-microtubulos movidos a miose.
As células podem rastejar, auto-curar e sintonizar sua rigidez devido ao seu citoesqueleto notavelmente dinâmico. Como tal, a reconstituição de redes de biopolímeros citoesqueléticos pode levar a uma série de materiais ativos e adaptáveis. No entanto, a engenharia desses materiais com propriedades precisamente sintonizadas requer medir como a dinâmica depende da composição da rede e dos métodos de síntese. Quantificar tais dinâmicas é desafiado por variações ao longo do espaço de tempo, espaço e formulação de redes compostas. O protocolo aqui descreve como a técnica de análise Fourier, microscopia dinâmica diferencial (DDM), pode quantificar a dinâmica das redes de biopolímeros e é particularmente adequada para estudos de redes de citoesqueleto. O DDM trabalha em sequências temporais de imagens adquiridas usando uma série de modalidades de microscopia, incluindo confocal de varredura a laser, fluorescência de campo largo e imagens de campo brilhante. A partir dessas sequências de imagem, pode-se extrair tempos característicos de descorrelação de flutuações de densidade através de um período de vetores de onda. Um pacote Python de código aberto fácil de usar para realizar análises DDM também é desenvolvido. Com este pacote, pode-se medir a dinâmica dos componentes de citoesqueleto rotulados ou de partículas rastreadoras incorporadas, como demonstrado aqui com dados de redes de filamento intermediário (vimentin) e redes ativas de actin-microtúbulos. Usuários sem experiência prévia de programação ou processamento de imagens poderão executar DDM usando este pacote de software e documentação associada.
O citoesqueleto é uma rede de filamentos proteicos que se estende pelo citoplasma das células eucarióticas, conectando a superfície celular ao núcleo. Possui propriedades materiais únicas, fornecendo proteção mecânica contra cargas mecânicas grandes e repetidas, mas também conduzindo mudanças dinâmicas de forma celular1. Redes de citoesqueleto reconstituídas podem dar origem a uma série de comportamentos dinâmicos interessantes, desde o envelhecimento de partículas incorporadas até o movimento balístico impulsionado por motores moleculares 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Os métodos para analisar a dinâmica dessas redes incluem o rastreamento do movimento de microesferas rastreadoras incorporadas 6,7,12,13,14, análise de imagem para rastrear o tamanho de aglomerados densos de proteínas ao longo do tempo8, dispersão de luz dinâmica15, velocimetria de imagem de partículas 4,16,17,18,19 , calculando a densidade espectral de energia das imagens ao longo do tempo19, e análise de kymógrafo20. À medida que mais estudos sobre redes de citoesqueleto reconstituídas são realizados, seja para entender a mecânica celular ou a matéria ativa, métodos robustos, imparciales e reprodutíveis para caracterizar a dinâmica são cada vez mais necessários. A microscopia dinâmica diferencial (DDM)21,22, uma técnica relativamente nova que tem sido usada para estudar a dinâmica do citoesqueleto, é uma dessas técnicas que quantifica eficientemente a dinâmica com poucos parâmetros definidos pelo usuário. Com o pacote de software descrito aqui, pesquisadores com pouca experiência em programação ou análise de imagens poderão aproveitar o DDM para seu próprio trabalho.
DDM é uma técnica de análise de imagem para extrair a dinâmica de uma amostra. Como o rastreamento de partículas ou a velocimetria de imagem de partículas, o DDM requer uma série de imagens temporizais (muitas vezes milhares de imagens), tipicamente gravadas com um microscópio. Ao contrário do rastreamento de partículas, características individuais ou contas rastreadoras não precisam ser localizadas (ou mesmo localizáveis) na imagem. Ao contrário do rastreamento de partículas e da velocimetria de imagem de partículas, recupera-se a dinâmica do conjunto com DDM com relativamente poucos parâmetros especificados pelo usuário. Com o DDM, as imagens são analisadas no espaço Fourier para determinar o tempo de decomposição das flutuações de densidade sobre uma faixa de números de ondas, q, onde q = 2πu, e u é a magnitude das frequências espaciais, . Um deles obtém informações semelhantes à dispersão, mas com imagens de espaço real adquiridas em um microscópio 21,22,23. Portanto, pode-se aproveitar os vários métodos geradores de contraste da microscopia, como fluorescência de campo largo22,24, fluorescência confocal25,polarizado 26, campo escuro27 ou fluorescência de folhas claras28 microscopias. Além disso, imagens usadas para análise de DDM podem ser usadas para rastreamento de partículas ou velocimetria de imagem de partículas para fornecer informações complementares.
Essa combinação de características de dispersão dinâmica de luz e microscopia óptica faz do DDM uma técnica poderosa e versátil. Desde sua primeira descrição por Cerbino e Trappe em 200821, onde o DDM foi demonstrado para medir a difusão de partículas coloidais de 73 nm, O DDM tem sido usado para medir coloidesfluindo 29, agregação coloidal 30,31, a viscoelasticidade dos cristais líquidos nemáticos26, a dinâmica dos géis coloidais32, espumas grosseiras33, nanopartículas em ambientes confinados34, 35,36,37, motilidade bacteriana 38,39,40,41, a difusão de aglomerados proteicos fracamente dispersantes42, ondas capilares nas interfaces fluidas43, e outros sistemas. Aqueles que buscam uma listagem mais completa das publicações que empregam DDM podem consultar artigos de revisão minuciosas sobre o assunto 22,23,44,45.
A DDM também tem sido usada para investigar a dinâmica das redes biológicas. Drechsler et al. usaram DDM para medir a dinâmica da actina em oócitos de Drosophila vivos 46. Burla et al. quantificaram a dinâmica das partículas rastreadoras em redes de compostos hialuronan e hialuronan-colágeno47. Vários usos do DDM para estudar a dinâmica das partículas rastreadoras em redes de citoesqueleto reconstituídas 9,10, o transporte de moléculas de DNA nessas redes48,49, e a dinâmica das redes ativas reconstituídas também foram documentados 11,50,51. Uma vantagem do DDM na medição da dinâmica em tais sistemas é que partículas individuais ou moléculas não precisam ser localizadas e rastreadas. Assim, por exemplo, a dinâmica das moléculas de DNA em ambientes lotados pode ser medida com DDM, apesar da dificuldade em rastrear moléculas tão pequenas e não esféricas. Além disso, com a microscopia de fluorescência, pode-se usar rotulagem multicolorida para medir seletivamente a dinâmica dos constituintes individuais em um composto complexo.
Para executar o DDM, uma sequência de imagens é tirada ao longo do tempo, eu (x,y,t). Para um determinado tempo de atraso, Δt, todos (ou um subconjunto de) pares de imagens separados por esse tempo de atraso são encontrados. A transformação de Fourier ao quadrado da diferença de cada par,
é computado e mediado juntos. Essa quantidade, é radialmente mediada, desde que a dinâmica seja isotrópica. Isso rende a matriz DDM (também referida como função da estrutura de imagem),
. Este processo é mostrado graficamente na Figura 1. Para determinar a dinâmica da amostra a partir desta matriz DDM, a matriz DDM é assumida para tomar a forma
onde A é a amplitude, que depende dos detalhes do microscópio e da estrutura da amostra, B é o fundo, que depende do ruído nas imagens, e f (q, Δt) é a função de dispersão intermediária (ISF), que contém informações sobre a dinâmica21,22. Em casos simples,
onde τ é um tempo característico de decadência ou descomprência. Tal ISF tem sido utilizado em diversos estudos que empregam DDM em sistemas ergodódicos como suspensões coloidais diluídas 21,24,27,37,40,52. No entanto, outras formas do ISF podem ser usadas para modelar vários tipos de dinâmica. Por exemplo, pode-se usar uma expansão cumulante para modelar o ISF para amostras de polidisperse como
onde μ é uma medida da polidispersidade42,53; se as flutuações de densidade decairem por dois modos separados, pode-se usar um ISF como
26, 54, 55, 56, 57;
outros ISFs podem ser usados para microrganismos na natação ou outras partículas ativas 38,39,40,41,58,59.
Figura 1: Visão geral da análise do DDM. A partir da série temporal de imagens, a transformação fourier das diferenças de imagem é calculada para calcular a matriz DDM. A matriz DDM pode ser adequada a um modelo para determinar a escala de tempo das flutuações de densidade em uma faixa de valores q . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Aqui, o uso de um pacote de software de análise DDM desenvolvido em Python, PyDDM, é descrito. Este pacote de software baseia-se no trabalho feito por nossos laboratórios de pesquisa e outros estudos publicados ao longo dos últimos anos. Os principais motivadores para a criação deste pacote de software incluem a necessidade de (1) acompanhar e armazenar metadados e parâmetros utilizados na análise; (2) documentação completa com exemplos detalhados de análise do início ao fim; e (3) uma maneira fácil de empregar diferentes (ou criar novos) modelos matemáticos para a montagem dos dados (por exemplo, adicionar modelos ISF, como os recentemente desenvolvidos para filamentos ativos60, seria simples). Outros pacotes de software para análise de DDM também existem, embora nem todos estejam bem documentados e escritos em uma linguagem de programação de código aberto. Por exemplo, há código C++ com computação em GPUs (https://github.com/peterlu/ConDDM)25, código C++ que usa transformações fourier no tempo para acelerar cálculos (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, versões MATLAB e Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, código MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27 e código MATLAB com quantificação de incerteza ( quantificação de incerteza ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. Como este pacote PyDDM é bem documentado e fornece muita flexibilidade na forma como a matriz DDM é calculada e analisada, ela pode ser útil para pesquisadores que procuram implementar DDM, independentemente de seu histórico em programação ou análise de imagem.
O protocolo mostra como este pacote de software pode ser usado para quantificar a dinâmica de redes de citoesqueleto in vitro reconstituídas. Isso é feito usando dois conjuntos distintos de dados de imagem: (1) imagens de partículas rastreadoras de submicron incorporadas em uma rede de vimentina tomada com microscopia de campo brilhante e (2) imagens de filamentos de actina fluorescente e filamentos de microtúbulos em uma rede composta emaranhada com atividade movida a miosina tomada com microscopia confocal de varredura a laser. As análises desses dois conjuntos de dados destacam pontos fortes notáveis do DDM, incluindo sua capacidade de analisar imagens tiradas com uma variedade de modalidades de imagem (por exemplo, fluorescência de campo brilhante ou constrangida), extrair dinâmicas de rastreadores incorporados ou de filamentos rotulados, e quantificar uma variedade de dinâmicas (por exemplo, subdiffusivas e restritas ou balísticas).
O pacote de software descrito aqui usa DDM para analisar flutuações de densidade observadas em imagens adquiridas usando um microscópio óptico. Os resultados representativos dos dados de partículas rastreadoras incorporadas nas redes de vimentina foram mostrados pela primeira vez. A análise desses dados pode ser usada para caracterizar o tamanho e rigidez da malha da rede de forma semelhante à forma como o rastreamento de partículas únicas tem sido usado em muitos estudos anteriores de redes de citoesqueleto 6,12,13. Uma vantagem de usar DDM sobre o rastreamento de partículas únicas é que o DDM não exige que as partículas sejam localizadas. Portanto, mesmo em imagens onde a densidade de partículas é muito alta ou as partículas muito pequenas para localizar e rastrear, o DDM ainda pode determinar a dinâmica. Onde o rastreamento de partículas únicas seria vantajoso é ao inspecionar a variabilidade partícula-partícula. Com o DDM, encontra-se a dinâmica média do conjunto, enquanto que, com o rastreamento de partículas únicas, pode-se calcular tanto o MSD de uma única partícula quanto o MSD médio do conjunto. No entanto, o DDM pode ser usado para investigar dinâmicas heterogêneas analisando várias regiões de interesse dentro de um grande campo de visão.
Em seguida, foram apresentadosresultados representativos de dados de filamentos rotulados fluorescentemente em uma rede ativa composta por dois tipos de filamento citoesqueléticos diferentes. Com esses dados, o movimento balístico foi caracterizado sem precisar de características localizáveis dentro da imagem. Uma vez que o DDM extrai a dinâmica média do conjunto com poucas entradas de usuário, torna a comparação de séries de imagens adquiridas com diferentes condições simples (por exemplo, comparando amostras com diferentes proporções de actina com microtúbulos ou amostras com diferentes concentrações de mosina, como feito em50). Além disso, usando imagens fluorescentes, podemos investigar a dinâmica de diferentes componentes de uma rede usando rotulagem multicolorida. Isso foi feito em 11,50, onde a dinâmica da actina e dos microtúbulos foram analisadas separadamente em uma rede composta ativa actin-microtúbula utilizando imagens multicoloridas. Na seção de resultados representativos aqui, apenas os resultados do canal microtúbulo foram mostrados, mas em trabalhos anteriores, comparamos a dinâmica dos filamentos microtúbulo e actin11.
Notamos que esses resultados representativos mostram subdiffusão passiva ou movimento balístico ativo. É importante ressaltar que o DDM pode ser usado para analisar sistemas onde há um crossover no tipo de dinâmica em escalas intermediárias de tempo ou comprimento. Como exemplos, Kurzthaler et al. usaram DDM com um sistema de coloides Janus ativos para explorar o movimento direcionado ativo em escalas de curto prazo e randomização da orientação em escalas de tempo mais longas59; Giavazzi et al. usaram DDM com espuma grosseira e encontraram um crossover na dinâmica correspondente à escala de comprimento de uma bolha33; e Cho et al. usaram DDM com géis coloidais e encontraram três regimes distintos em diferentes escalas de comprimento que abrangem desde os aglomerados fractais até toda a rede32.
Os dados incluídos na seção de resultados representativos foram adquiridos com microscopia de campo brilhante e microscopia confocal de varredura a laser. No entanto, como observado anteriormente, o DDM pode ser usado com muitas modalidades de imagem. Com qualquer modalidade de imagem, os usuários devem considerar configurações ópticas, como o grau de seção óptica ou a profundidade de campo. Um alto grau de seção óptica pode reduzir o sinal de objetos fora de foco, mas não será capaz de medir com precisão a dinâmica sobre escalas de tempo maiores do que a escala de tempo para os objetos saírem da profundidade do campo25,28. Uma discussão mais aprofundada sobre como a profundidade de campo dependente de Q afeta a análise de DDM pode ser encontrada em22. Para imagens de brightfield, os usuários também podem precisar considerar a espessura da amostra. Enquanto para amostras de dispersão fraca, amostras mais grossas podem fornecer mais sinal42, amostras turvas podem exigir a modificação da análise para explicar a dispersão múltipla81. Finalmente, para métodos de imagem que não são invariantes de espaço linear (ou seja, onde a intensidade registrada pela câmera de um objeto depende de onde esse objeto está no plano de amostra x-y), pode-se precisar explicar a variância do espaço linear, como demonstrado com ddm de campo escuro27.
Para quem começa com dDM, queremos enfatizar a importância de considerar a resolução espacial e temporal. Ao inspecionar os tempos de decadência determinados em função do número de ondas, é importante marcar os limites de sua resolução (ou seja, os tempos máximos e mínimos de defasagem e o número máximo de ondas, como feito na Figura 5). Deve-se pensar cuidadosamente sobre esses limites antes de coletar dados para que a lente objetiva ideal, tamanho da imagem, taxa de quadro e duração do filme possam ser selecionadas. A outra consideração importante é como estimar o parâmetro de fundo B. Múltiplos métodos para estimar o fundo têm sido utilizados na literatura, e os efeitos do excesso ou subestimação B foram descritos em publicações anteriores62,77. Como mostrado na Figura 10, o PyDDM permite que os usuários implementem diferentes métodos para estimar B, e sugerimos que novos usuários experimentem esses métodos e avaliem quais são apropriados para usar.
Uma força deste pacote é sua documentação completa e passo a passo com dados de exemplo, o armazenamento e a organização de metadados para acompanhar como as análises foram realizadas e a flexibilidade em como analisar a matriz DDM (vários modelos de montagem, múltiplos métodos para estimar o parâmetro de fundo B, a capacidade de encontrar o MSD). No entanto, existem vários aspectos neste código que poderiam ser melhorados. Atualmente, o código não foi otimizado para velocidade de computação rápida. Foram relatados métodos para acelerar o cálculoem 61,62, e estes serão implementados em versões futuras. Além disso, planejamos implementar métodos recentemente relatados para melhor estimar incertezas e empregar simulações para orientar os usuários ao modeloISF 62 apropriado. Para outras melhorias, esperamos que os usuários entrem em contato conosco com sugestões.
The authors have nothing to disclose.
Partes desta pesquisa foram financiadas por um Prêmio National Institutes of Health R15 (Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais). R15GM123420, concedido à R.M.R.-A. e R.J.M.), um Cottrell Scholar Award da Research Corporation for Science Advancement (prêmio nº 27459, concedido a R.J.M.), e um William M. Keck Foundation Research Grant (concedido à R.M.R-A.). GHK agradece o apoio financeiro do Dutch Research Council (NWO; projeto número VI.C.182.004 do NWO Talent Program).
CMOS camera, Orca-Flash 4.0 | Hamatsu | ||
F-127 Pluronic | Sigma Aldrich | ||
Jupyter Notebook | |||
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
Nikon Ti-Eclipse microscope | Nikon | ||
PLL-PEG-bio | SuSos AG, Dübendorf, Switzerland | ||
Polystyrene beads | Sigma Aldrich | ||
Protein dialysis mini-cassette | Thermo Fisher | ||
PyDDM | University of San Diego | N/A | Open source software available from https://github.com/rmcgorty/PyDDM |