血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine,The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science,Northwest University, 6Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine
Summary
本プロトコルは、末梢血および固体組織から細胞外小胞を抽出し、その後表面抗原およびタンパク質カーゴのプロファイリングを行う方法を記載している。
Abstract
循環および組織常在性細胞外小胞(EV)は、新しいセラノスティックバイオマーカーとして有望な標的であり、生物の恒常性の維持と幅広い疾患の進行において重要なプレーヤーとして浮上しています。現在の研究は、エンドソーム起源の内因性エクソソームの特性評価に焦点を当てていますが、原形質膜からブリングするマイクロベシクルは、親細胞の膜シグネチャを再現する豊富な表面分子を特徴とする健康と病気においてますます注目を集めています。ここでは、血漿および骨などの固体組織からEVを抽出して特性評価するための差動遠心分離に基づく再現可能な手順を示します。このプロトコルはさらに、EVの表面抗原とタンパク質貨物のその後のプロファイリングについて説明しており、したがって、それらの派生物を追跡可能であり、潜在的な機能に関連する成分で識別されます。この方法は、生物学的、生理学的、病理学的研究におけるEVの相関的、機能的、および機構的解析に役立ちます。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、さまざまな生理学的および病理学的イベント2において重要な役割を果たす細胞放出脂質二重層封入細胞外構造1を定義するために提案されています。健康な細胞から放出されるEVは、細胞内エンドサイトーシス輸送経路3を介して形成されるエクソソーム(または小型EV)と、細胞4の原形質膜の外出芽によって発生するマイクロベシクル(または大型EV)の2つの主要なカテゴリーに大きく分類できます。多くの研究は、in vitro5で培養細胞から収集されたEVの機能に焦点を当てていますが、循環または組織に由来するEVはより複雑で不均一であり、生体内の生物の真の状態を反映するという利点があります6。さらに、ほぼすべての種類の組織が生体内でEVを産生することができ、これらのEVは組織内でメッセンジャーとして機能したり、さまざまな体液、特に末梢血によって移動したりして、全身コミュニケーションを促進することができます7。循環および組織内のEVも疾患の診断および治療の対象である8.
近年、エクソソームの研究が盛んに行われているのに対し、マイクロベシクルは重要な生物学的機能も備えており、超遠心なしで容易に抽出できるため、基礎研究や臨床研究が進められています9。特に、循環および組織から分離されたEVに関する重要な問題は、それらが異なる細胞型に由来することです10。マイクロベシクルは原形質膜から剥がれており、豊富な細胞表面分子が特徴であるため9、親細胞膜マーカーを使用してこれらのEVの細胞起源を特定することが可能です。具体的には、フローサイトメトリー(FC)技術を適用してメンブレンマーカーを検出することができます。さらに、研究者はEVを隔離し、機能的な貨物に基づいてさらに分析を行うことができます。
本プロトコルは、in vivoサンプルからEVを抽出して特性評価するための徹底的な手順を提供します。EVは示差遠心分離によって単離され、EVの特性評価には、ナノ粒子追跡分析(NTA)および透過型電子顕微鏡(TEM)による形態同定、FCによる起源分析、およびウェスタンブロットによるタンパク質貨物分析が含まれます。マウスの血漿および上顎骨が代表として使用される。研究者は、他のソースからのEVについてこのプロトコルを参照し、対応する変更を加えることができます。
Protocol
動物実験は、第4軍事医科大学の施設動物管理および使用委員会のガイドラインおよびARRIVEガイドラインに従って実施されました。本研究では、8週齢のC57Bl/6マウス(雌または雄のいずれも選好しない)を使用した。血漿および組織EVの分離に関連するステップを 図1に示します。血漿は、体液からのEV分離手順を説明するための代表として採用されています。上顎骨を代表?…
Representative Results
実験ワークフローによれば、末梢血および固形組織からEVを抽出することができます(図1)。8週齢のマウスの上顎骨は約0.1±0.05gであり、マウスから約300μLの血漿を採取することができる。プロトコルステップに従って、それぞれ0.3 mgおよび3 μgのEVを収集できます。TEMとNTAで分析したように、EVの典型的な形態学的特徴は、直径50〜300 nmの範囲の丸いカップ状の膜小胞です(…
Discussion
EVの特徴、運命、機能を研究する際には、歩留まりが高く汚染の少ないEVを分離することが重要です。EVを抽出するには、密度勾配遠心分離(DGC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、イムノキャプチャアッセイなど、さまざまな方法があります4,20。ここでは、最も一般的に使用される方法の1つである示差遠心分離が使用されました。これの利点は?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(32000974、81870796、82170988、および81930025)および中国ポスドク科学財団(2019M663986およびBX20190380)からの助成金によってサポートされました。国立基礎医学実験教育実証センター(AMFU)の支援に感謝しています。
Materials
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Cao, Y., Qiu, J., Chen, D., Li, C., Xing, S., Zheng, C., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).