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Biologia

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

Published: October 17, 2022
doi:
10.3791/63990
, , , , , , , ,
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine,The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science,Northwest University, 6Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

Summary

본 프로토콜은 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링과 함께 말초 혈액 및 고형 조직으로부터 세포외 소포를 추출하는 방법을 설명한다.

Abstract

순환 및 조직 상주 세포외 소포(EV)는 새로운 테라노스틱 바이오마커로서 유망한 표적을 나타내며 유기체 항상성 유지 및 광범위한 질병의 진행에 중요한 역할을 합니다. 현재 연구는 엔도솜 기원을 가진 내인성 엑소좀의 특성화에 초점을 맞추고 있지만, 원형질막에서 흘러나오는 미세소포는 모세포의 막 시그니처를 요약하는 풍부한 표면 분자를 특징으로 하는 건강과 질병 분야에서 점점 더 주목을 받고 있습니다. 여기서는 혈장 및 뼈와 같은 고형 조직에서 EV를 추출하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 기반으로 재현 가능한 절차가 제시됩니다. 이 프로토콜은 EV의 표면 항원 및 단백질 화물의 후속 프로파일링을 추가로 설명하며, 따라서 파생을 추적할 수 있고 잠재적 기능과 관련된 구성 요소로 식별됩니다. 이 방법은 생물학적, 생리학적, 병리학적 연구에서 EV의 상관적, 기능적, 기계론적 분석에 유용할 것입니다.

Introduction

세포외 소포체(EV)는 다양한 생리학적 및 병리학적 사건2에서 중요한 역할을 하는 세포 방출 지질 이중층으로 둘러싸인 세포외 구조1를 정의하기 위해 제안되었다. 건강한 세포에서 방출되는 EV는 크게 두 가지 주요 범주, 즉 세포내 세포내 트래피킹 경로3를 통해 형성된 엑소좀(또는 작은 EV)과 세포의 원형질막4의 바깥쪽 출아에 의해 발달하는 미세소포(또는 대형 EV)로 나눌 수 있다. 많은 연구가 시험관 내에서 배양된 세포에서 채취한 EV의 기능에 초점을 맞추고 있지만5, 순환계나 조직에서 유래한 EV는 더 복잡하고 이질적이어서 생체 내 유기체의 실제 상태를 반영하는 이점이 있다 6. 또한, 거의 모든 종류의 조직이 생체 내에서 EV를 생산할 수 있으며, 이러한 EV는 조직 내에서 메신저 역할을 하거나 다양한 체액, 특히 말초 혈액에 의해 전달되어 전신 통신을 촉진할 수 있다7. 순환계와 조직 속의 전기차는 질병 진단과 치료의 표적이기도 하다8.

최근 몇 년 동안 엑소좀이 집중적으로 연구되고 있는 반면, 마이크로베시클은 또한 중요한 생물학적 기능을 가지고 있어 초원심분리 없이 쉽게 추출할 수 있어 기초 및 임상 연구를 촉진한다9. 특히, 순환계와 조직에서 분리된 EV와 관련된 중요한 문제는 EV가 서로 다른 세포 유형에서 유래한다는 것이다10. 마이크로베지클은 원형질막에서 흘러나오고 풍부한 세포 표면 분자9를 특징으로 하기 때문에, 이들 EV의 세포 기원을 식별하기 위해 모 세포막 마커를 사용하는 것이 가능하다. 특히, 유세포 분석(FC) 기술을 적용하여 멤브레인 마커를 검출할 수 있습니다. 또한 연구원들은 EV를 분리하고 기능성 화물을 기반으로 추가 분석을 수행할 수 있습니다.

본 프로토콜은 생체내 샘플로부터 EV를 추출하고 특성화하기 위한 철저한 절차를 제공한다. EV는 차등 원심분리를 통해 분리되며, EV의 특성화에는 나노입자 추적 분석(NTA) 및 투과 전자 현미경(TEM)을 통한 형태학적 식별, FC를 통한 기원 분석, 웨스턴 블롯을 통한 단백질 화물 분석 이 포함됩니다. 생쥐의 혈장과 상악골이 대표로 사용됩니다. 연구원은 다른 출처의 EV에 대해 이 프로토콜을 참조하고 해당 수정을 수행할 수 있습니다.

Protocol

동물실험은 제4군의과대학 기관동물관리이용위원회 가이드라인과 ARRIVE 가이드라인에 따라 수행하였다. 본 연구에서는 8주령의 C57Bl/6 마우스(암컷 또는 수컷 모두 선호 없음)를 사용했습니다. 혈장 및 조직 EV를 분리하는 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 플라즈마는 체액으로부터 EV 분리 절차를 설명하기 위해 대표적으로 사용됩니다. 상악골은 고형 조직으로부터 EV 분리 절?…

Representative Results

실험 워크플로에 따라 EV는 말초 혈액 및 고형 조직에서 추출할 수 있습니다(그림 1). 생후 8주령 마우스의 상악골은 약 0.1 ± 0.05 g이며, 마우스로부터 약 300 μL의 혈장을 채취할 수 있다. 프로토콜 단계에 따라 각각 0.3mg 및 3μg의 EV를 수집할 수 있습니다. TEM과 NTA에 의해 분석된 바와 같이, EV의 전형적인 형태학적 특성은 직경이 50-300nm 범위인 둥근 컵 모양의 막 소포입니다(<stro…

Discussion

EV의 특징, 운명 및 기능을 연구할 때 높은 수율과 낮은 오염으로 EV를 분리하는 것이 중요합니다. 밀도 구배 원심분리(DGC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 면역포획 분석(immunocapture assay)과 같은 EV를 추출하기 위한 다양한 방법이 있습니다 4,20. 여기서 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나 인 차등 원심 분리가 사용되었습니다. 이것의 장점은 시간이…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32000974, 81870796, 82170988 및 81930025)과 중국 박사후 과학 재단 (2019M663986 및 BX20190380)의 보조금으로 지원되었습니다. AMFU (National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine)의 도움에 감사드립니다.

Materials

4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot
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Riferimenti

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician’s point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).

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Keywords: Extracellular VesiclesIsolationAnalysisPlasmaSurface AntigensProtein CargoesFlow CytometryMaxillary BoneLiberaseCentrifugationPBSSample Processing
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Cao, Y., Qiu, J., Chen, D., Li, C., Xing, S., Zheng, C., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).
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