Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.
Les vésicules extracellulaires (VE) circulantes et résidentes dans les tissus représentent des cibles prometteuses en tant que nouveaux biomarqueurs théranostiques, et elles apparaissent comme des acteurs importants dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme et la progression d’un large éventail de maladies. Alors que les recherches actuelles se concentrent sur la caractérisation des exosomes endogènes d’origine endosomale, les microvésicules qui s’échappent de la membrane plasmique ont attiré de plus en plus d’attention dans les domaines de la santé et de la maladie, qui se caractérisent par une abondance de molécules de surface récapitulant la signature membranaire des cellules mères. Ici, une procédure reproductible est présentée basée sur la centrifugation différentielle pour extraire et caractériser les VE du plasma et des tissus solides, tels que l’os. Le protocole décrit en outre le profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons protéiques des véhicules électriques, qui sont donc traçables pour leurs dérivations et identifiés avec des composants liés à la fonction potentielle. Cette méthode sera utile pour l’analyse corrélative, fonctionnelle et mécaniste des VE dans les études biologiques, physiologiques et pathologiques.
Des vésicules extracellulaires (VE) ont été proposées pour définir les structures extracellulaires enfermées dans la bicouche lipidiquelibérée par les cellules 1, qui jouent un rôle important dans divers événements physiologiques et pathologiques2. Les VE libérés par les cellules saines peuvent être divisés en deux catégories principales, à savoir les exosomes (ou petits VE) formés par une voie de trafic endocytaire intracellulaire3 et les microvésicules (ou gros VE) développées par le bourgeonnement vers l’extérieur de la membrane plasmique de la cellule4. Alors que de nombreuses études portent sur la fonction des VE prélevés in vitrosur des cellules cultivées 5, les VE issus de la circulation ou des tissus sont plus complexes et hétérogènes, ce qui a l’avantage de refléter l’état réel de l’organisme in vivo6. En outre, presque tous les types de tissus peuvent produire des VE in vivo , et ces VE peuvent agir comme messagers dans le tissu ou être transférés par divers fluides corporels, en particulier le sang périphérique, pour faciliter la communication systémique7. Les VE dans la circulation et les tissus sont également des cibles pour le diagnostic et le traitement des maladies8.
Alors que les exosomes ont été intensivement étudiés ces dernières années, les microvésicules ont également des fonctions biologiques importantes, qui peuvent être facilement extraites sans ultracentrifugation, favorisant ainsi la recherche fondamentale et clinique9. Notamment, un problème critique concernant les VE isolés de la circulation et des tissus est qu’ils sont dérivés de différents types de cellules10. Étant donné que les microvésicules sont soufflées à partir de la membrane plasmique et caractérisées par une abondance de molécules de surface cellulaire9, il est possible d’utiliser des marqueurs membranaires cellulaires parents pour identifier l’origine cellulaire de ces VE. Plus précisément, la technique de cytométrie en flux (FC) peut être appliquée pour détecter les marqueurs membranaires. De plus, les chercheurs peuvent isoler les véhicules électriques et effectuer d’autres analyses en fonction des cargaisons fonctionnelles.
Le présent protocole prévoit une procédure rigoureuse pour extraire et caractériser les VE à partir d’échantillons in vivo. Les VE sont isolés par centrifugation différentielle, et la caractérisation des VE comprend l’identification morphologique par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique à transmission (MET), l’analyse d’origine par FC et l’analyse de la cargaison de protéines par transfert Western. Le plasma sanguin et l’os maxillaire des souris sont utilisés comme représentants. Les chercheurs peuvent se référer à ce protocole pour les VE provenant d’autres sources et apporter les modifications correspondantes.
Lors de l’étude des caractéristiques, du devenir et de la fonction des véhicules électriques, il est crucial d’isoler les véhicules électriques à haut rendement et à faible contamination. Diverses méthodes existent pour extraire les VE, telles que la centrifugation par gradient de densité (DGC), la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et les tests d’immunocapture 4,20. Ici, l’une des méthodes les plus couramment utilisées, la centrifu…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000974, 81870796, 82170988 et 81930025) et de la China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 et BX20190380). Nous sommes reconnaissants de l’aide du Centre national expérimental de démonstration de l’enseignement de la médecine de base (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |