В настоящем протоколе описан способ извлечения внеклеточных везикул из периферической крови и солидных тканей с последующим профилированием поверхностных антигенов и белковых грузов.
Циркулирующие и резидентные в тканях внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой многообещающие мишени в качестве новых тераностических биомаркеров, и они становятся важными игроками в поддержании гомеостаза организма и прогрессировании широкого спектра заболеваний. В то время как текущие исследования сосредоточены на характеристике эндогенных экзосом эндосомального происхождения, микровезикулы, выделяющиеся из плазматической мембраны, привлекают все большее внимание к здоровью и болезням, которые характеризуются обилием поверхностных молекул, повторяющих мембранную сигнатуру родительских клеток. Здесь представлена воспроизводимая процедура, основанная на дифференциальном центрифугировании для извлечения и характеристики EV из плазмы и твердых тканей, таких как кость. Далее в протоколе описывается последующее профилирование поверхностных антигенов и белковых грузов EV, которые, таким образом, прослеживаются на предмет их происхождения и идентифицируются с компонентами, связанными с потенциальной функцией. Этот метод будет полезен для коррелятивного, функционального и механистического анализа ЭВ в биологических, физиологических и патологических исследованиях.
Внеклеточные везикулы (ВВ) были предложены для определения высвобождаемых клетками липидных двухслойных внеклеточных структур1, которые играют важную роль в различных физиологических и патологических событиях2. ЭВ, высвобождаемые здоровыми клетками, можно разделить на две основные категории, а именно экзосомы (или малые ВВ), образующиеся через внутриклеточный эндоцитарный путьтрафика 3 , и микровезикулы (или большие ЭВ), развивающиеся в результате почкования плазматической мембраны клетки4 наружу. В то время как многие исследования сосредоточены на функции ЭВ, собранных из культивируемых клеток in vitro5, ВВ, полученные из кровообращения или тканей, являются более сложными и неоднородными, что имеет то преимущество, что отражает истинное состояние организма in vivo6. Кроме того, почти все виды тканей могут продуцировать ЭВ in vivo , и эти ЭВ могут действовать как мессенджеры внутри ткани или переноситься различными жидкостями организма, особенно периферической кровью, для облегчения системной коммуникации7. ВВ в кровообращении и тканях также являются мишенями для диагностики и лечения заболеваний8.
В то время как экзосомы интенсивно изучались в последние годы, микровезикулы также обладают важными биологическими функциями, которые могут быть легко извлечены без ультрацентрифугирования, что способствует фундаментальным и клиническим исследованиям9. Примечательно, что критическая проблема, касающаяся EV, выделенных из кровообращения и тканей, заключается в том, что они получены из разных типов клеток10. Поскольку микровезикулы выводятся из плазматической мембраны и характеризуются обилием молекулклеточной поверхности 9, возможно использование маркеров родительской клеточной мембраны для идентификации клеточного происхождения этих EV. В частности, метод проточной цитометрии (FC) может быть применен для обнаружения мембранных маркеров. Кроме того, исследователи могут изолировать электромобили и проводить дальнейший анализ на основе функциональных грузов.
Настоящий протокол предусматривает тщательную процедуру извлечения и определения характеристик электромобилей из образцов in vivo. EV выделяют с помощью дифференциального центрифугирования, а характеристика EV включает морфологическую идентификацию с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM), анализ происхождения с помощью FC и анализ белкового груза с помощью вестерн-блоттинга. В качестве представителей используется плазма крови и верхнечелюстная кость мышей. Исследователи могут ссылаться на этот протокол для электромобилей из других источников и вносить соответствующие изменения.
При изучении особенностей, судьбы и функций электромобилей крайне важно изолировать электромобили с высокой производительностью и низким уровнем загрязнения. Существуют различные методы извлечения EV, такие как центрифугирование в градиенте плотности (DGC), эксклюзионная хроматографи…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32000974, 81870796, 82170988 и 81930025) и Китайского фонда постдокторантуры (2019M663986 и BX20190380). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментально-учебному демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |