Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Summary

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Abstract

Hücrelerin dış sinyallere cevap verme yeteneği, hücresel gelişim, büyüme ve hayatta kalma için gereklidir. Ortamdan gelen bir sinyale yanıt vermek için, bir hücre onu tanıyabilmeli ve işleyebilmelidir. Bu görev esas olarak, rolü sinyalleri hücrenin biyokimyasal diline dönüştürmek olan membran reseptörlerinin işlevine dayanır. G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), insanlarda membran reseptör proteinlerinin en büyük ailesini oluşturur. GPCR'ler arasında, metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR'ler), zorunlu dimerler olarak işlev gören ve ligand bağlanma bölgesini içeren geniş bir hücre dışı alana sahip benzersiz bir alt sınıftır. mGluR'lerin yapısal çalışmalarındaki son gelişmeler, aktivasyon süreçlerinin anlaşılmasını geliştirmiştir. Bununla birlikte, aktivasyon ve modülasyon sırasında mGluR'ler yoluyla büyük ölçekli konformasyonel değişikliklerin yayılması tam olarak anlaşılamamıştır. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), biyomoleküllerin yapısal dinamiklerini tek protein seviyesinde görselleştirmek ve ölçmek için güçlü bir tekniktir. mGluR2 aktivasyonunun dinamik sürecini görselleştirmek için, reseptörlerin doğal yapısını bozmadan bölgeye özgü protein etiketlemesine izin veren doğal olmayan amino asit (UAA) entegrasyonuna dayanan floresan konformasyonel sensörler geliştirilmiştir. Burada açıklanan protokol, yeni UAA etiketleme yaklaşımı, numune hazırlama ve smFRET veri toplama ve analizi dahil olmak üzere bu deneylerin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Bu stratejiler genelleştirilebilir ve çeşitli membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini araştırmak için genişletilebilir.

Introduction

Plazma zarı boyunca bilgi aktarımı büyük ölçüde membran reseptörlerinin işlevine bağlıdır1. Bir reseptöre bağlanan ligand, konformasyonel bir değişikliğe ve reseptör aktivasyonuna yol açar. Bu süreç genellikle doğada allosteriktir2. 800'den fazla üyesi olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), insanlarda membran reseptörlerinin en büyük ailesidir3. Neredeyse tüm hücresel süreçlerdeki rolleri nedeniyle, GPCR'ler terapötik gelişim için önemli hedefler haline gelmiştir. GPCR sinyallemesinin kanonik modelinde, agonist aktivasyonu, daha sonra Gα nükleotid bağlanma cebinde GTP için GDP değişimi yoluyla heterotrimerik G protein kompleksini aktive eden reseptörün konformasyonel değişiklikleriyle sonuçlanır. Aktive edilen Gα-GTP ve Gβγ alt üniteleri daha sonra aşağı akış efektör proteinlerinin aktivitesini kontrol eder ve sinyal kaskadın 4,5'i yayar. Bu sinyal verme işlemi esas olarak ligandların reseptörün üç boyutlu şeklini değiştirme yeteneğine bağlıdır. Ligandların bunu nasıl başardığına dair mekanik bir anlayış, yeni terapötikler geliştirmek ve sentetik reseptörler ve sensörler tasarlamak için kritik öneme sahiptir.

Metabotropik glutamat reseptörleri (mGluR'ler) C sınıfı GPCR ailesinin üyeleridir ve glutamatın yavaş nöromodülatör etkileri ve nöronal uyarılabilirliğin ayarlanması için önemlidir 6,7. Tüm GPCR'ler arasında, C sınıfı GPCR'ler, zorunlu dimerler olarak işlev görmeleri nedeniyle yapısal olarak benzersizdir. mGluR'ler üç yapısal alan içerir: Venüs flytrap (VFT) alanı, sistein bakımından zengin etki alanı (CRD) ve transmembran alanı (TMD)8. Aktivasyon işlemi sırasındaki konformasyonel değişiklikler karmaşıktır ve 12 nm mesafeye yayılan yerel ve küresel konformasyonel kuplajın yanı sıra dimer kooperatifçiliğini de içerir. Ara konformasyonlar, devletlerin zamansal sıralaması ve devletler arasındaki geçiş hızı bilinmemektedir. Bireysel reseptörlerin konformasyonunu gerçek zamanlı olarak takip ederek, geçici ara durumları ve aktivasyon sırasında konformasyonel değişikliklerin sırasını tanımlamak mümkündür. Bu, mGluR2 11'in aktivasyonu sırasında konformasyonel değişikliklerin yayılımını görselleştirmek için yakın zamanda uygulandığı gibi, tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi 9,10 (smFRET) uygulanarak elde edilebilir. FRET deneylerinde önemli bir adım, donör ve alıcı floroforların ilgili proteine bölgeye özgü yerleştirilmesiyle FRET sensörlerinin üretilmesidir. Sisteinsiz mutantların oluşturulmasını veya genetik olarak kodlanmış büyük bir etiketin eklenmesini gerektiren tipik bölgeye özgü floresan etiketleme teknolojilerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için doğal olmayan bir amino asit (UAA) birleştirme stratejisi 12,13,14,15 benimsenmiştir. Bu, mGluR2'nin ligand bağlama ve sinyal alanlarını birleştiren temel kompakt allosterik bağlayıcının konformasyonel olarak yeniden düzenlenmesinin gözlenmesine izin verdi. Bu protokolde, bakır katalizörlü azid siklizasyon reaksiyonunu kullanarak floroforları bağlamak için mGluR2'nin UAA ile sahaya özgü etiketlenmesi yaklaşımı da dahil olmak üzere, mGluR2 üzerinde smFRET deneyleri gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sunulmaktadır. Ayrıca, bu protokol membran proteinlerinin doğrudan yakalanması ve veri analizi için metodolojiyi açıklamaktadır. Burada özetlenen protokol, diğer membran proteinlerinin konformasyonel dinamiklerini incelemek için de geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokolün genel iş akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.

1. Numune odasının hazırlanması

  1. Sürgü ve kapak kayması temizliği
    NOT: Bu adımlar, kızakların yüzeylerini ve kapak kaymalarını temizlemeyi ve bunları aminosilanizasyona hazırlamayı amaçlamaktadır. Yüzeye bağlı moleküller üzerinde tek moleküllü floresan deneyleri yapmak için kritik bir gereklilik, pasifleştirilmiş bir yüzeydir. En güvenilir ve tekrarlanabilir pasivasyon tekniği, inert polimer zincirlerinin cam yüzeye yoğun bir tabaka olarak kovalent olarak tutturulmasını içerir. Polietilen glikol (PEG), yüzey pasivasyonu için kullanılan en verimli polimerdir16. PEG (PEGylation) kullanan pasivasyon prosedürünün ayrıntıları aşağıda açıklanmıştır:
    1. Kızaklarda delinecek delikleri bir işaretleyici ile işaretleyin (~6 mm uzakta ve kenardan uzakta). Cam kızak üzerinde küçük delikler (1 mm çapında) açmak için bir Dremel kullanın. Sondaj işlemi sırasında kaydırakları suya batırın.
    2. İşaretçiden kalan mürekkebi çıkarmak için slaytları asetonla yıkayın.
    3. Asetondan çıkarın ve slaytları suyla durulayın, ardından yüksek güçte (700 W) suda 5 dakika boyunca mikrodalgada pişirin.
    4. Slaytları, sonikleştirilecek bir cam vitray kavanoza koymadan önce suyla temizleyin. Kapak kapaklarını farklı bir boyama kavanozuna yerleştirin.
    5. Slaytları ve kapakları asetonda 30 ° C'de bir banyo sonikatöründe 23 dakika boyunca sonikleştirin.
    6. Bu arada, bir sonraki adımda kullanılan aminosilantizasyon çözeltisini hazırlamak için bir cam şişeyi temizleyin. Şişeyi 1 M KOH ile doldurun, şişeyi 30 dakika boyunca sonikleştirin, KOH'yi suyla iyice durulayın ve ardından metanol içinde 30 dakika daha sonikleştirin. Şişeyi aminosilantizasyon adımına kadar metanol içinde bırakın.
    7. Bu arada, aminosilan, mPEG ve biotin-PEG'i dondurucudan (-20 ° C) çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığına (RT) gelmelerine izin verin.
    8. Asetonu slayttan ve kapaklı kavanozlardan uygun kimyasal atık kabına atın, suyla iyice durulayın ve ardından slaytları 30 dakika boyunca 5 M KOH'da sonikleştirin.
    9. Slaytları ve örtüleri suyla durulayın ve ardından 2 dakika boyunca metanol içinde sonikasyon yapın (iki kez tekrarlayın). Kavanozları metanol ile dolu olarak aminosilizasyon adımına kadar bırakın.
      NOT: Bu çalışmada, aksi belirtilmedikçe deiyonize su kullanılmıştır. 23 ° C'de çalışan bir banyo sonicator kullanılır.
  2. Aminosilantizasyon
    NOT: Bu adım, aminosilanı temiz sürgü ve kapak kayması yüzeyine kovalent olarak bağlamayı amaçlamaktadır. İşlevselleştirilmiş mPEG ve biotin-PEG bir sonraki adımda bu yüzeye kovalent olarak bağlanacaktır.
    1. Temiz bir şişede bir aminosilantasyon karışımı hazırlayın (adım 1.6). Metanol (150 mL), asetik asit (7,5 mL, cam pipet kullanın) ve aminosilan (2,5 mL) karıştırarak çözeltiyi hazırlayın.
    2. Çözeltiyi kimyasal duman davlumbazında yavaşça karıştırın, ardından sürgü ve kapak kayması kavanozlarına dökün. Kapak fişleri için 50 mL ve slaytlar için 100 mL kullanın. Kızakların ve kapak kaymalarının çözeltiye tamamen daldırıldığından emin olun.
    3. 10 dakika boyunca inkübe edin, daha sonra kavanozları 1 dakika boyunca sonikleştirin (sonikasyon yüzeydeki safsızlıkları giderir) ve 10 dakika daha kuluçkaya yatırın.
    4. Aminosilatörizasyon çözeltisini atık toplama kabına atın. Kavanozlara metanol ekleyin, kavanozları kapaklarla kapatın ve elle hafifçe sallayın. Metanolü atın ve kavanozları suyla doldurun.
    5. Aminosilan şişeyi dondurucuya geri koyun (-20 ° C).
  3. PEGilasyon
    NOT: Bu adımlarda PEGylation yordamı açıklanmaktadır.
    1. Aminosilanizasyon sırasında, pegilasyon tamponunu hazırlayın. 84 mg sodyum bikarbonat (NaHCO3) tartın ve 10 mL suya (10 mM) ekleyin. Ek olarak, mPEG ve biotin-PEG'i tartın ve bir kenara koyun. Altı slayt ve kapak kapağı için 96 mg mPEG ve 1.2-2.4 mg biotin-PEG kullanın.
      NOT: Arka plan noktalarının sayısını artırabileceğinden çok fazla biotin-PEG eklememek önemlidir. PEG karışımını slaytlara uygulamadan hemen öncesine kadar eritmeyin.
    2. Slaytları suyla durulayın, hafif bir hava üfleme ile kurutun ve ardından nemlendirilmiş montaj kutularına yerleştirin.
      NOT: Temiz bir havayolu kullanmak önemlidir. Camda kalıntı bırakabilecek basınçlı konserve hava kullanmaktan kaçının.
    3. PEG toz karışımına pegilasyon tamponu ekleyin ve çözünmesi için yavaşça birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Slayt başına 55 μL pegilasyon tamponu ekleyin (altı slayt için 330 μL pegilasyon tamponu ekleyin).
    4. Çözünmemiş parçacıkları çökeltmek için 23 ° C'de 1 dakika boyunca 9.600 x g'de santrifüj yapın. Bir sonraki adımda kullanmak üzere süpernatantı toplayın.
      NOT: Biotin-PEG, NHS grubunun varlığı nedeniyle hızla hidrolize olur. Karıştırma ve santrifüjleme adımlarını hızlı bir şekilde yapmak önemlidir.
    5. Her slayta 60 μL PEGilasyon çözeltisi uygulayın ve ardından PEGilasyon çözeltisinin slayt ve kapak kayması arasına sıkıştırılması için kapak kaymasını üstüne yerleştirin.
      NOT: Kızak ve kapak kayması arasına kabarcıklar sokmaktan kaçının, çünkü bu pasivasyon verimliliğini azaltacaktır. Kapak kaymasını ve sürgüyü pipet ucuyla ayarlayarak kabarcıkları çıkarın.
    6. Slaytları düz ve karanlık bir çekmeceye yerleştirin. Slaytlar gece boyunca saklanabilir; Bununla birlikte, 4-6 saat boyunca inkübasyon optimum pasivasyon ile sonuçlanır.
      NOT: Hangi tarafın pegile edildiğini hatırlamak önemlidir.
    7. Depolamadan önce pegile edilmemiş tarafı işaretleyin. Kuluçkadan sonra, slaytları ve kapakları yavaşça sökün ve suyla iyice durulayın.
    8. Slaytları ve kapakları hava üfleyerek kurulayın. Kızakları ve kapak kaymalarını, PEGile edilmiş yüzey birbirinden uzağa bakacak şekilde steril bir tüp (50 mL) içinde tutun. Deney gününe kadar -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Slaytları ve kapak fişlerini hazırlandıktan sonraki 4 hafta içinde kullanmak en iyisidir. PEGile edilmiş yüzeyler birbirinden uzağa bakmalıdır. PEGile edilmiş slaytların ve kapak kapaklarının vakumla kapatılmış torbalarda saklanması raf ömrünü uzatabilir.

2. Doğal olmayan amino asit, floresan etiketleme ve ekstraksiyon içeren mGluR2 ekspresyonu

NOT: Bu protokol, UAA 4-azido-L-fenilalanin (AZP) içeren mGluR2'yi eksprese etmek için hücrelerin hazırlanmasını, reaktiflerini ve tedavisini özetlemektedir. Prosedür, 18 mm cam kapaklar üzerinde yetiştirilen HEK293T hücreleri içindir. Prosedür gerektiğinde büyütülebilir.

  1. Tohumlama
    NOT: DMEM'deki HEK293T hücrelerini, %10 (v/v) fetal sığır serumu, 100 ünite·mL−1 penisilin-streptomisin ve 15 mM HEPES tamponu (Ek Dosya 1) (pH 7.4) ile %5 CO2 altında 37 °C'de saklayın.
    1. Hücreleri% 0.05 tripsin-EDTA ile geçirin. Poli-L/D-lizin (PLL/PDL) cam kapaklar üzerindeki tohum HEK293T hücreleri, transfeksiyon sırasında %≥80 akıcılığa ulaşacak şekilde kayar.
  2. Transfeksiyon
    1. 0,1 M NaOH'de 40 mM'lik bir AZP stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Büyüyen hücreler ve mGluR2 ekspresyonu için AZP takviyeli ortam hazırlayın. 40 mM AZP stok çözümü kullanarak ek standart ortam (+ FBS, kalem/strep, 15 mM HEPES). Son AZP konsantrasyonunu 0,6 mM'ye getirin. 1 M HEPES çözeltisi ekleyin (40 mM AZP stok çözeltisinin hacminin yarısı eklendi). Örneğin, 10 mL AZP takviyeli ortam hazırlamak için 9,775 mL standart ortam, 150 μL 40 mM AZP stok çözeltisi ve 75 μL 1 M HEPES çözeltisini birleştirin.
    3. Bir şırınga filtresi (0,2 μm, PES) kullanarak ortamı filtreleyin (sterilize edin).
    4. Transfeksiyondan önce standart ortamı AZP takviyeli ortam içeren ortamlarla değiştirin.
      NOT: Ortamın değiştirilmesi sırasında hücreleri kurutmamaya dikkat edin.
    5. Hücreleri transfeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosu) ile üreticinin el kitabını izleyerek transfekte edin. Toplam 2 μg DNA (1000 ng tRNA/sentetaz + 1000 ng amber kodon içeren protein plazmidi) kullanılarak 18 mm'lik bir kapak parçası üzerindeki Transfect HEK293T hücreleri. Kullanılan bileşenlerin konsantrasyonu ve hacmi için Tablo 1'e bakınız.
    6. Transfeksiyondan 24 saat sonra medyayı taze AZP takviyeli ortama değiştirin ve hücrelerin 24 saat daha büyümesine izin verin.
  3. Alkinli siyanin boyalarla etiketleme
    1. Etiketlemeden 20 dakika önce, kapak kapaklarını iki kez ılık (37 °C) kayıt arabelleği (RB) (Ek Dosya 1) ile yıkayın ve AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES) içermeyen sıcak (37 °C) standart ortama taşıyın.
    2. Cy3-alkin, Cy5-alkin, BTTES, bakır (II) sülfat (CuSO4), (+) sodyum L-askorbat ve aminoguanidin içeren etiketleme çözeltisini hazırlayın.
    3. Çözüm oluşturma ve ekleme sırasını takip edin (Tablo 2):
      1. 50 mM BTTES hazırlayın.
      2. 100 mM aminoguanidin hazırlayın.
      3. 100 mM Na-askorbat hazırlayın.
      4. 655.5 μL RB hazırlayın.
      5. RB'ye Cy3/Cy5 alkin boyası (DMSO stokunda 10 mM) ekleyin.
        NOT: RB'ye aminoguanidin ekleyin.
      6. 20 mM CuSO4 hazırlayın.
      7. CuSO4 ve BTTES'i yeni bir tüpte karıştırın (çözelti maviye dönecektir).
      8. CuSO4 ve BTTES karışımını RB'ye ekleyin (2.3.3.6.)
      9. Na-Askorbat'ı ekleyin.
      10. 18 mm'lik bir kapak kayması için aşağıdaki Tablo 2'de verilen hacmi takip edin.
    4. Çözeltiyi iyice karıştırın ve hücreleri etiketlemeden önce 10 dakika boyunca buz üzerinde ve karanlıkta inkübe edin.
    5. Etiketleme solüsyonunu kapak kapaklarına eklemeden önce, ortamı çıkarın ve RB ile yıkayın. Etiketleme solüsyonunu ekleyin ve karanlık koşullarda 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    6. NOT: Etiketlemeyi iyileştirmek için, 10 dakika sonra glutamat (son konsantrasyon ~ 0,5 mM) ekleyin ve 5 dakika daha inkübe edin. Bakır hücreler için çok toksiktir ve etiketleme reaksiyonu in vivo olarak 15 dakikadan fazla devam etmemelidir. Tüm bileşenleri taze hazırlayın. En son Na-Askorbat ekleyin. Hazırlanırken reaksiyonu 4°C'de tutun. Bununla birlikte, etiketleme çözeltisinin eklenmesi üzerine, hücreler inkübatörün içinde 37 ° C'de saklanmalıdır.
  4. Hücrelerin toplanması ve proteinlerin çıkarılması (hücre lizisi)
    1. Etiketleme solüsyonunu çıkarın ve mGluR2 transfekte edilmiş hücreleri içeren kapak kapağını (18 mm) RB ile iki kez yıkayın.
    2. Bir pipet kullanarak, hücreleri kapak kapağından yıkayın ve RB'de (1 mL) yeniden askıya alın.
      NOT: Bu noktadan sonra numunenin ışığa maruz kalmasını mümkün olduğunca en aza indirin.
    3. 4 °C'de 1.000 x g'de 5 dakika dönerek hücreleri pelet edin ve süpernatanı çıkarın. Hücre peletini lizis çözeltisinin 80-130 μL'sinde yeniden askıya alın.
      NOT: Hücre peleti gözle görülebilmelidir. Lizis hacmi, etiketleme ve yıkama işlemi sırasında kaybedilen numune miktarına bağlıdır.
    4. Peleti parçalamak için pipetle hafifçe karıştırın. Folyoyu sarın ve hücreleri lize etmek için 4 ° C'de rocker'ın üzerine 0.5-1 saat boyunca yerleştirin.
    5. Çözünmeyen fraksiyonu 20.000 x g ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Süpernatantı taze bir soğuk tüpe (floresan olarak etiketlenmiş proteini içeren lize protein) aktarın ve deneyler için buz üzerinde saklayın.

3. Tek moleküllü akış odası montajı ve işlevselleştirme

  1. Sürgüyü ve kapak kapağını dondurucudan çıkarın ve karanlıkta RT'de ısınmalarını bekleyin (~ 30 dakika).
  2. Kızak ve kapak kayması arasında çift taraflı bant şeritlerini sandviçleyerek odacığı çift taraflı bant kullanarak monte edin. PEGile edilmiş yüzeylerin akış odasının içini oluşturduğundan emin olun.
  3. Bir pipet ucu kullanarak, bandın hem kapak kayması hem de kızak ile tam temas ettiğinden emin olmak için kapak kapağına basın; kapak fişini kırmamaya dikkat edin. Slaytların kenarlarına epoksi uygulayın.
    NOT: Delinen deliklere epoksi dolacak kadar fazla şey eklemeyin.
  4. Epoksinin kurumasını sağlamak için akış odasını kapak kayması tarafı aşağı bakacak şekilde nemlendirilmiş karanlık bir kutuya yerleştirin (~ 30 dakika).
    NOT: Epoksinin kurutma süresi boyunca delikleri (10-15 μL) kaplamasını önlemek için delinmiş deliklerden T50 tamponu (Ek Dosya 1) ekleyin.
  5. Her bir bölme şeridini 500 nM Neutravidin (T50'de seyreltilmiş) ile her şeride yavaşça ~40 μL uygulayarak inkübe edin.
  6. RT'de nemlendirilmiş karanlık bir kutunun içinde 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Şerit başına ~100 μL T50 tampon ile yıkayın.
  7. Her hazne şeridini 20 nM biyotinillenmiş antikor11 ile inkübe edin. Antikor seçimi, protein üzerindeki etikete bağlıdır.
    NOT: Birincil antikor biyotinile edilmemişse, önce biyotinile sekonder antikor ile 30 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra birincil antikor ile inkübe edin.
  8. RT'de nemlendirilmiş karanlık bir kutunun içinde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatın. Şerit başına ~200 μL T50 ile yıkayın.
    NOT: Hazırlık işlemi sırasında şeritlerin asla kurumadığından emin olun.

4. Tek moleküllü tamponlar

  1. Trolox tampon
    NOT: Trolox tamponu, görüntüleme tamponu oluşturmak için başlangıç tamponudur. Tamponun bileşenleri deneye bağlıdır ve ilgilenilen proteine bağlı olarak değişebilir. Burada açıklanan protokolde kullanılan tampon, tuzları (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), tamponlama maddesini (HEPES) ve Trolox'u (pH ~ 7.35) içerir.
    1. 9-10 mg Trolox'u 10 mL tek moleküllü kayıt tamponunda çözün (SRB, Ek Dosya 1)
      NOT: Trolox tamponu hafif asidik hale getirir. Bu aşamada pH'ı sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi, 10 M (pH 7.35) kullanarak ayarlayın. İnce pH ayarı, Trolox tamamen çözüldükten sonra yapılacaktır; Bununla birlikte, bu noktada pH'ın arttırılması, Trolox'un çözünürlüğünü arttırır.
    2. Trolox'u tamamen çözmek için çözeltiyi RT'de 4-8 saat boyunca (alüminyum folyoya sarılı) bir tezgah üstü rocker kullanarak karıştırın.
    3. PH'ı kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
    4. Trolox'un tamamen çözündüğünden emin olun. Çözeltiyi bir şırınga filtresi ile sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Arabellek 2-10 günlük yaşlanmadan sonra kullanılmalıdır. Trolox yanıp sönmeyi bastırmaya yardımcı olur ve tek moleküllü çalışmalarda yaygın olarak kullanılır17. Göz kırpmayı önleyici özellikler, Trolox18'in oksitlenmiş bir türevinden gelir; Bu nedenle, olgunlaşması için RT'de en az birkaç saat tutulması önerilir. Ek olarak, taze Trolox çözeltisinin UV radyasyonu oksidasyon sürecini hızlandırır ve Trolox tamponu18'in "yaşlanmasını" hızlandırmak için kullanılabilir.
  2. Görüntüleme tamponu tarifi: Trolox tamponu + deterjan (deterjanın CMC değerinin ~2 katı) + 4 mM protokateçuik asit (PCA) karıştırın.
    NOT: Yüksek deterjan konsantrasyonları protein denatürasyonunun artmasına neden olabileceğinden deterjan konsantrasyonu CMC'nin yakınında tutulur. Örneğin, aşağıdaki karışım 955 μL Trolox + 5 μL% 10 DDM + kolesterol (W% 10: 1) + 40 μL 100 mM PCA stok çözeltisi kullanılabilir. Burada, PCA bir antioksidan ajan olarak işlev görür ve daha önce smFRET çalışmalarında kullanılmıştır19. DDM iyonik değildir, membran proteinleri 20,21'i çözündürmek için yaygın olarak kullanılır ve tek moleküllü çalışmalarda kullanılmıştır. DDM iyi bir ilk tercih deterjandır; ancak, birden fazla deterjanı test etmenizi ve sonuçların tutarlı olmasını sağlamanızı öneririz.

5. Mikroskop kurulumu ve smFRET veri toplama

  1. Bilgisayarı ve mikroskobu açın. Isınmak için lazerleri açın (Cy3 uyarımı için 532 nm ve Cy5 uyarımı için 640 nm).
    NOT: Burada, 100x TIRF hedefi (N.A. 1.49), görüntü ayırıcı ve EMCCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılmıştır. Kurulum, dört hatlı bir lazer birleştirici, bir dikroik ayna, uzun geçişli bir emisyon filtresi, bir emisyon dikroik filtresi ve bir çentik filtre ile donatılmıştır.
  2. EMCCD kamerayı açın ve kamera yazılımını açın. Fotoğraf makinesinin -69 °C'ye ulaşması ve stabilize olması için 20 dakika bekleyin.
  3. Örnek odasını mikroskop aşamasına monte edin. Görüş alanı başına ~ 400 molekül elde etmek için protein örneğini kademeli olarak ekleyin (adım 2.4.5). Odayı 100 μL görüntüleme tamponu ile yıkayın.
  4. Kazancı, edinme oranını ve lazer güçlerini, hem donör hem de alıcı kanallarında tek moleküllü floresan sinyalleri tespit edilecek şekilde ayarlayın. Gerekirse numune odasındaki proteinlerin konsantrasyonunu ayarlayın.
    NOT: Görüş alanında 400'den fazla molekül bulunduğundan, molekülleri tek tek ayırt etmek daha zor hale gelir ve arka plan gürültüsü daha yüksek olur.
  5. Donörü heyecanlandırın ve görüş alanındaki donör moleküllerinin en az% 80'i fotobeyazlatılana kadar zaman izleri elde edin.
  6. Filmin sonunda, alıcı moleküllerin bir kısmı fotobeyazlatıcıya kadar alıcıyı doğrudan uyarmak için 640 nm lazeri açın ve multimer ayrımcılığından tek molekülü kolaylaştırın.
  7. Farklı bir görüş alanına geçin ve koşul başına en az üç film (teknik çoğaltma) toplamak için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    NOT: Yeni bir ilgi alanı (ROI) seçerken ve fotobeyazlatmayı en aza indirmek için odaklanırken mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın. Satın alma sırasında sahne sürüklenmesine dikkat edin. Yeni bir yatırım getirisine geçtikten sonra gözle görülür bir kayma gözlenirse, satın almaya başlamadan önce 3 dakika bekleyin.

6. Veri analizi

  1. Donör ve alıcı kanal hizalaması (film eşleme)
    1. Floresan boncuk görüntülerini donör ve alıcı kanallarına kaydedin.
    2. Her molekülden22,23 donör ve alıcı floresansını ilişkilendirmek için boncuk verilerini kullanarak eşleme dosyasını oluşturun.
      NOT: Tek bir molekülden gelen emisyon sinyali, görüntü ayırıcının içindeki emisyon dikroik filtresi tarafından donör ve alıcı sinyallere bölünür. Donör ve alıcı görüntüleri kameraya yan yana yansıtılır. İki alan arasındaki tek bir molekülün donör ve alıcı yoğunluklarını doğru bir şekilde ilişkilendirmek için, genellikle floresan boncuk örnekleri kullanılarak bir haritalama dosyası oluşturulur. Bu haritalama dosyası kullanılarak, donör ve alıcı kanallarında tespit edilen tüm moleküller birbirine eşlenir. Analiz daha sonra her molekül için zaman içindeki donör ve alıcı yoğunlukları olan zaman izlerini üretir.
  2. Tek moleküllü FRET izlerinin seçimi (partikül toplama)
    NOT: Tek tek parçacık izleri, MATLAB kullanılarak aşağı akış analizi için incelenir ve seçilir. Tam seçim kriterleri sisteme bağlıdır. Kaliteli bir parçacığı neyin oluşturduğuna dair genel kurallar burada özetlenmiştir. Özel olarak değiştirilmiş tüm kodlar GitHub'da (https://github.com/vafabakhsh-lab) mevcuttur.
    1. İzlerin toplam yoğunluğunun (donör + alıcı) zaman içinde sabit olduğu izleri seçin. Donör ve alıcı yoğunluklarında anti-korelasyon değişiklikleri olan izleri seçin.
    2. Tek adımlı fotobeyazlatma gösteren donör ve alıcı molekülleri seçin. >5 s uzunluğundaki izleri seçin.
      NOT: Ağartmadan sonra her kanaldaki arka plan sıfıra gitmelidir. İzlerde çok fazla yanıp sönen olay olmamalıdır; bu analiz zorluğunu artıracaktır.
    3. FRET verimliliğini E = (I A− 0.088 × I D)/(I D + [I A− 0.088 × I D])24,25,26 denklemini kullanarak hesaplayın, burada I D ve I A sırasıyla ham donör ve alıcı yoğunluklarıdır.
      NOT: Donör emisyonunun alıcı kanala sızması, 532 nm lazer26 kullanılarak uyarılan yalnızca donör etiketli numune kullanılarak belirlenir. Sızıntı düzeltme faktörü 0,088, kullanılan filtre setlerine bağlı olarak farklı kurulumlar için farklılık gösterebilir. FRET verimliliklerinin mutlak mesafelere nicel ve sağlam dönüşümünün, birden fazla faktör için donör ve alıcı yoğunluklarının düzeltilmesini gerektirdiğini ve27'den önce kapsamlı bir şekilde tartışıldığını belirtmek önemlidir.
  3. Gizli Markov Modellemesi (HMM) ile konformasyonel durumu tanımlayın
    1. MATLAB'da vbFRET28 programını çalıştırın ve belirli bir koşul için seçilen izlemeleri içe aktarın. Yürütülecek olası durumların ve yinelemelerin sayısı için kısıtlamaları ayarlayın.
      NOT: Temsili sonuçlardan elde edilen ham verilere dayanarak, konformasyonel sensör tarafından işgal edilen dört ayrı FRET durumu olduğu varsayılmıştır; Böylece, bir ila dört devletten oluşan bir aralık belirlendi. Uyumdaki iyileştirmelerin daha önce >25 yineleme ile ihmal edilebilir bir şekilde artacağı belirlendi; Böylece, temsili verileri sığdırmak için 25 yineleme kullanılmıştır.
    2. smFRET izlemelerini analiz edin ve idealize edilmiş izlemeleri ve analiz oturumunu dışa aktarın. İdealize edilmiş izlemeleri aşağı akış analizi için ayrı bir klasöre kaydedin.
      NOT: İdealize edilmiş izlemelerden durum geçişi ve bekleme süresi verilerini ayıklamak için kullanılan programlar, daha önce yayınlanmış29 numaralı çalışmada kullanıma sunulmuştur.
    3. MATLAB programlarını kullanarak, durum geçişlerini ayıklayın ve bunları başlangıç konformasyonunu gösteren X-koordinatı ve bitiş konformasyonunu gösteren Y-koordinatı ile bir ısı haritası olarak çizin.
      NOT: Geçişler, burada tartışılan temsili sonuçlarda FRET değerindeki >0,1 olarak tanımlanır. Geçişler için eşik, bir ilgi proteininin kapladığı varsayımsal konformasyonel durumlara (geçiş eşiğini en yakın FRET durumları arasındaki farktan daha az olacak şekilde ayarlayın) ve deneysel kurulumun izin verdiği çözünürlüğe bağlıdır. Isı haritalarının çoklu koşullar için incelenmesi, bir sensörün içinden geçtiği ve dolayısıyla işgal ettiği en yaygın konformasyonel durumların tanımlanmasını sağlar. Temsili sonuçlar için dört FRET durumu tanımlandı (FRET = 0.31, 0.51, 0.71 ve 0.89).
    4. MATLAB programlarını kullanarak, tanımlanan her konformasyonel durum için bekleme sürelerini ayıklayın. Veri toplama sırasında her durumu ve zaman çözünürlüğünü tanımlayan bir dizi FRET değeri belirleyin. FRET aralıkları, bitişik FRET durumlarına eşit olarak bölünür. Belirli tedavi koşulları için bekleme sürelerini dışa aktarın.
      NOT: Çoğu durumda, bekleme süresi verileri tek bir üstel bozunma fonksiyonu ile iyi tahmin edilebilir. Bu analiz bir veri analizi ve grafik yazılımında gerçekleştirilebilir.
  4. Devlet doluluğunu ölçmek için smFRET popülasyon histogramlarının Gauss uyumu
    1. İlgilenilen koşullar için popülasyon FRET histogramlarını veri analizine ve çoklu tepe noktası analizi için grafik yazılımına aktarın.
    2. Mevcut tepe noktalarının sayısını belirtin (HMM analizine dayalı dört tepe noktası veya durum). Uydurma, A'nın tepe alanı, xc'nin tepe merkezi ve w'nin her tepe için tepe genişliği olduğu30 olarak Equation 1tanımlanan çoklu Gauss dağılımları kullanılarak gerçekleştirildi.
    3. Montaj parametrelerini A > 0, xc = FRET ± 0,02 ve 0,1 ≤w≤ 0,24 olarak sınırlayın. Bireysel popülasyon FRET histogramları için dört FRET zirvesi aynı anda yerleştirildi. Tüm koşulların bağlantı parçaları için tanımlanmış kısıtlamaları uygulayın.
    4. Doluluk durumunu (yüzde), tüm zirvelerin toplamı olarak tanımlanan toplam alana bölünen ilgi alanı olarak hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UAA tabanlı FRET sensörünün ekspresyon ve floresan etiketlemesi
Burada, mGluR2 (548UAA) CRD'si içinde bir UAA'nın (AZP) yerleştirilmesi ve floresan etiketlemesinin örnek sonuçları tartışılmıştır11. Daha önce de belirtildiği gibi, AZP'yi mGluR2'ye yerleştirmek için, modifiye edilmiş bir tRNA sentetaz ve tamamlayıcı tRNA (pIRE4-Azi) içeren mühendislik translasyonel makinesinin ve mutagenez kullanılarak oluşturulan 548 pozisyonunda bir amber kodon içeren mGluR2'nin birlikte ekspresyonu gereklidir (Şekil 2A, B). AZP'nin siyanin boyaları ile etiketlenmesi, bakır katalizörlü bir sikloekleme reaksiyonu (Şekil 2C) ile elde edilir ve 548UAA'nın etkili plazma membran etiketlemesi ile sonuçlanır (Şekil 2D). Tam uzunlukta 548UAA'nın çevirisini ve dimerik reseptörün bütünlüğünü doğrulamak için, Cy5 ile etiketlenmiş 548UAA'yı eksprese eden HEK293T hücrelerinden hücre lizatı üzerinde SDS-PAGE elektroforezi gerçekleştirildi. Tam uzunluktaki dimerik mGluR2 ile çakışan 250KDa'da tek bir bant gözlendi (Şekil 2E).

Veri toplama ve analizi
C-terminal FLAG-etiketi ile 548UAA eksprese eden hücreler Cy3 (donör) ve Cy5 (alıcı) ile etiketlendi ve daha sonra in vitro çalışma için bir proteaz inhibitörü varlığında deterjan31 ile lize edildi. Hücre lizisinin tamamlanması ve çözünmeyen fraksiyonun santrifüjleme ile uzaklaştırılması üzerine, süpernatant, toplam iç yansıma floresansı (TIRF) görüntüleme için bir anti-FLAG-etiket antikoru ile işlevselleştirilmiş bir polietilen glikol (PEG) pasifleştirilmiş örtü parçası üzerine uygulandı (Şekil 3). Numune 532 nm lazer kullanılarak aydınlatıldı ve parçacıklar smCamera yazılımı kullanılarak aşağı akış analizi için seçildi. Ham donör, alıcı ve FRET izleri smCamera'da seçilen tüm moleküller için üretildi ve MATLAB kullanılarak seçildi (bölüm 6; Şekil 4). Burada kullanılan deney düzeni için alıcı yoğunluklarına %8.8'lik bir donör kanama düzeltmesi uygulanmıştır. Bu düzeltme faktörü, kullanılan deney düzeneği, dikroik filtreler ve emisyon filtreleri ile değişecektir ve yalnızca donör floroforu ile etiketlenmiş hücreler kullanılarak standart deneysel koşullar altında donör ve alıcı sinyallerinin ölçülmesi ve kanamanın hesaplanması ([alıcı yoğunluğu] / [donör yoğunluğu]) hesaplanarak belirlenmelidir. Şekil 4, birkaç temsili FRET izini ve karşılık gelen donör ve alıcı sinyallerini göstermektedir. Bu izler daha önce protokolde açıklanan kriterler kullanılarak seçilmiştir (bölüm 6). Birden fazla durum ile donör ve alıcı beyazlatma olayları arasındaki geçişleri gösteren temsili seçilmiş izler Şekil 4B-D'de gösterilmiştir.

Konformasyonel durumların tanımlanması
548UAA'nın işgal ettiği konformasyonel durumları ve bu durumların birbirlerine göre ilişkilerini belirlemek için Gizli Markov modellemesi (HMM) analizi yapılmıştır. HMM analizi, MATLAB28 üzerinde yürütülen vbFRET programı kullanılarak yapıldı (Şekil 5A). Şekil 5, durum tanımlama sürecini göstermek için bir ara glutamat konsantrasyonundan (5μM) elde edilen verileri kullanır. Ham smFRET izlerine dayanarak, CRD için dört potansiyel FRET durumunun var olduğu varsayılmıştır. Böylece, devletlerin sayısı bir ila dört ile sınırlandırıldı. Genel olarak, mevcut durumların sayısını belirlemek için her iz için 25 uygulama yinelemesi gerçekleştirildi. Bu idealize edilmiş uyumlardan, ayrık FRET durumları arasındaki geçişler çıkarılabilir ve bir geçiş yoğunluğu ısı haritası olarak çizilebilir (Şekil 5B). Isı haritası, noktalı çizgilerle gösterilen 0.31, 0.51, 0.71 ve 0.89'daki dört ayrı FRET durumunu vurgular. Geçişler FRET >0.1'deki değişiklikler olarak tanımlandı. İdealize edilmiş FRET izleri, tanımlanan her konformasyon için bekleme süresi hakkında da bilgi verir (Şekil 5C).

Popülasyon FRET histogramı oluşturma ve tepe noktası uyumu
Daha ileri analizler için manuel olarak seçilen değişen glutamat konsantrasyonlarının varlığında 548UAA için temsili tek moleküllü izler Şekil 6A, B'de gösterilmiştir. smFRET deneyleri için genel bir analiz, her deneysel durum için yüzlerce smFRET izinden popülasyon histogramları üretmektir (Şekil 6C). Popülasyon FRET histogramları, beyazlatmadan önce izlerin segmentinden oluşturulur. Histogramın daha uzun izlerin davranışına doğru önyargılı olmasını önlemek için, ortalamadan önce her izden normalleştirilmiş bir FRET histogramı oluşturmak gerekir. Bu, her bir eserin son histograma eşit derecede katkıda bulunmasını sağlar. Bu sistemde, FRET histogramları, glutamat konsantrasyonunun artmasıyla daha yüksek FRIED'ye doğru genel bir kayma gösterir, bu da CRD'ler arasındaki mesafenin azalmasına ve aktif konformasyona doğru bir kaymaya işaret eder. Bununla birlikte, glutamat konsantrasyonundan bağımsız olarak, FRET sinyali oldukça düzensiz kalır ve CRD için yüksek derecede içsel dinamikleri gösterir. Daha yüksek FRET'e doğru genel kaymaya ek olarak, konformasyonel topluluğun yeniden dağılımı histogramda (renk eğrileri) belirginleşir. Bireysel moleküllerin bu konformasyonel durumları (kesikli çizgiler) ziyaret ettiği de görülebilir (Şekil 6B). Devlet doluluk olasılığını belirlemek için, zirve alanını, dört ayrı zirve alanının toplamı olarak tanımlanan toplam alana bölmek gerekir. mGluR2 CRD'sinin smFRET deneyinden üretilen smFRET histogramı, sırasıyla 0.31, 0.51, 0.71 ve 0.89'da (1-4 durumlarında etiketlenmiş) zirveleri olan dört dinamik durum gösterdi.

Figure 1
Şekil 1: Çalışma protokolünün akış şeması ve veri analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tıklama kimyası ile mGluR2'nin bölgeye özgü etiketlemesi. (A) Hücrelerde doğal olmayan amino asit 4-azido-L-fenilalanin birleşme işleminin şeması. (B) mGluR2'nin, doğal olmayan amino asit 548 pozisyonunda, bakır katalizörlü azid-alkin-alkin tıklama reaksiyonu ile bölgeye özgü floresan etiketlemesini gösteren şema. (C) Floresan olarak etiketlenmiş mGluR2'nin (yeşil donör molekülü, kırmızı alıcı molekül) Cy3 ve Cy5 moleküllerinin kenetlendiği üç boyutlu yapısı. (D) Tıklama kimyası yoluyla donör (yeşil: Cy3) ve alıcı (kırmızı: Cy5) floroforlarla etiketlenmiş hücre yüzey popülasyonu ile 548UAA'yı eksprese eden HEK293T hücrelerinin temsili konfokal mikroskop görüntüsü. Ölçek çubukları = 10 μm. (E) 548UAA'yı eksprese eden ve Cy5-alkinle etiketlenmiş HEK293T hücrelerinden hücre lizatının %4-%20 oranında azalan poliakrilamid jel elektroforezinin görüntüsü. Jel, 633 nm uyarma dalga boyu ve 670-BP30 emisyon filtresi-Lane a: protein merdiveni ile görüntülenir; şerit b: hücre lizatı; c şeridi: Cy5-alkinli boya. Sonuçlar bireysel bir deneyi temsil eder. B, D ve E panelleri Liauw ve ark.11'den yeniden kullanılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: SmFRET deneylerinin şematik gösterimi ve mikroskop kurulumu (TIRF). Donörün tek moleküllü floresan görüntüsü yeşil (ölçek çubuğu = 1000 nm) ve alıcı kırmızı renkte gösterilir. Donör bir lazer kullanarak 532 nm'de heyecanlandı. Alıcı, donörden FRET tarafından heyecanlandırılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Donör (yeşil) ve alıcı (kırmızı) etiketli mGluR2'nin yoğunluk izleri. (A) FRET probları arasındaki reseptör dinamiklerini ve mesafedeki değişimi gösteren karikatür. (B) Uzun ömürlü yüksek FRET durumu. (C) Önce alıcı fotobeyazlatma ve ardından donör fotobeyazlatma ile çoklu FRET durumları. (D) Alıcı fotobeyazlatma ile kısa ömürlü FRET durumu. (E) Alıcı fotobeyazlatma ile uzun ömürlü stabil FRET durumu. Bu rakam, Liauw ve ark.11'den minimum değişiklikle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Konformasyonel durum tanımlaması . (A) Karşılık gelen donör ve alıcı sinyaliyle birlikte idealize edilmiş uyum kaplamalı (kırmızı) temsili FRET izi. (B) 548UAA tarafından geçirilen en sık konformasyonel geçişleri vurgulayan geçiş yoğunluğu ısı haritası. Kesikli çizgiler FRET durumlarını gösterir. (C) Her konformasyonel durumun ortalama bekleme süreleri. Bu rakam, Liauw ve ark.11'den minimal bir değişiklikle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Tek moleküllü FRET, mGluR2 CRD'nin dört konformasyonel durumunu ortaya koymaktadır . (A) Solda donör kanalı (Cy3) ve sağda alıcı kanalı (Cy5) olan tek moleküllü bir filmden temsili çerçeve. Aşağı akış işleme için analiz yazılımı tarafından seçilen moleküller yeşil dairelerle gösterilir. Ölçek çubuğu = 3 μm. (B) Farklı glutamat konsantrasyonlarında 548UAA'nın örnek tek moleküllü zaman izleri. Donör (yeşil) ve alıcı (kırmızı) yoğunlukları ve karşılık gelen FRET (mavi) gösterilmiştir. Kesikli çizgiler dört ayrı FRET durumunu temsil eder. (C) Bir dizi glutamat konsantrasyonunda smFRET popülasyon histogramları. Veriler, N = 3 bağımsız deneyin ortalama ± SEM'ini temsil eder. Bu rakam, Liauw ve ark.11'den minimal bir değişiklikle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Genel protokolün özeti . (A) Doğal olmayan bir amino asit içeren bir proteini ifade eden hücrelerin büyütülmesi ve etiketlenmesi için iş akışı. (B) Konformasyonel durumları tanımlamak ve mGluR2'deki CRD alanının dinamik özelliklerini karakterize etmek için kullanılan tek moleküllü FRET deney ve analiz iş akışı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parça Hacim/Reaksiyon (μL)
İndirgenmiş Serum Ortamı 100
Transfeksiyon reaktifi 4.4
Parça Hacim/Reaksiyon (μL)
İndirgenmiş Serum Ortamı 100
P3000 Serisi 4
Yapı/Bileşen Adı Konsantrasyon (ng/μL) Hacim/kuyu (12 kuyulu) (μL) Kuyular (#) DNA Eklendi (μL)
tRNA/sentetaz 1000 1 1 1
Protein içeren amber kodon 1000 1 1 1

Tablo 1: HEK 293 T hücresinin transfeksiyonu için reaktifler.

Reaktif Eklenecek ses seviyesi (μL) Stok conc (mM) Son Conc (mM)
1x RB 655.5
cesaret 10.5 50 0.75
CuSO4 5.25 20 0.15
NaAsc Belediyesi 17.5 100 2.5
AminoG 8.75 100 1.25
Cy3-Alkin (10 mM) 1.25 10 0.018
Cy5-Alkin (10 mM) 1.25 10 0.018

Tablo 2: Etiketleme çözeltisinin bileşimi (kimyaya tıklayın).

Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan çeşitli tamponların bileşimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GPCR'ler, sinyal iletimini başlatmak için hücre zarı üzerinde çalışan proteinlerdir. Birçok GPCR, birden fazla alandan oluşur ve sinyalleme, etki alanları arasındaki işbirlikçi etkileşime bağlıdır. Bu membran reseptörlerinin özelliklerini modüle etmek için, çoklu alanların dinamik davranışını anlamak önemlidir. Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET), protein konformasyonu ve dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesini sağlayan bir floresan tekniğidir11,32. Burada, pasifleştirilmiş bir yüzey üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bireysel proteinlerin yeniden düzenlenmesini doğrudan görselleştirmek için smFRET, tek moleküllü pull-down (SiMPull) ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisini birleştiren bir yaklaşım tanımlanmıştır 5,11,33. FRET mesafeye karşı oldukça hassastır ve moleküler içi değişiklikleri (3-8 nm) araştırmak için uygun nano ölçekli bir cetvel olarak etkili bir şekilde işlev görür. Geleneksel biyofiziksel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, smFRET özellikle ~ 10 ms'lik bir zaman ölçeğinde büyük konformasyonel dinamiklerin incelenmesi için çok uygundur ve küçük bir numune hacmi gerektirir (deney başına yaklaşık 1 fmol). Ayrıca, nükleer manyetik rezonans (NMR)34 veya çift elektron-elektron rezonansı (DEER) spektroskopisi35 tarafından sağlananlar gibi konformasyonel dinamiklerin topluluk ölçümlerinin aksine, smFRET hem konformasyonel durumların hem de zaman sıralamalarının açık bir şekilde atanmasına ve nadir ve geçici ara durumların doğrudan tespitine izin verir.

Şu anda, bölgeye özgü floresan etiketlemenin sınırlamaları, proteinlerin konformasyon dinamiklerini incelemek için smFRET'nin daha geniş bir şekilde uygulanmasını engelleyen teknik bir zorluk oluşturmaktadır. Dahası, membran proteinlerini büyük miktarlarda saflaştırmak ve aktivitelerini korumak zordur. Yaygın etiketleme stratejileri büyük protein etiketleri kullanır veya minimal sistein mutantlarının üretilmesini gerektirir, bu da genellikle florofor konjugasyonunu maruz kalan sistein kalıntıları olmayan proteinlerin terminine kısıtlar. Bu sınırlamaları aşmak için, doğal olmayan bir amino asit (UAA) birleştirme stratejisi uyarlandı ve optimize edildi, bu da bakır katalizörlü bir tıklama reaksiyonu11,12,14 kullanılarak pertürbatif olmayan, kalıntıya özgü etiketlemeye izin verdi. Bu strateji, membran reseptörünün solvente maruz kalan bölgeleri boyunca floroforların konjuge edilmesini mümkün kılar ve daha geniş bir konformasyonel sensör dizisinin oluşturulmasını sağlar. Bu protokolde, tek tip konjugasyon kimyası kullanılmıştır. Bu, aşağı akış analizi sırasında atlanan donör-donör ve alıcı-alıcı popülasyonları ile sonuçlanır. Alternatif olarak, bundan kaçınmak veya ilgilenilen protein simetrik olmadığında olası heterojenliğin üstesinden gelmek için iki ortogonal etiketleme stratejisi kullanılabilir.

Proteinin doğrudan yakalanması, zaman alıcı ve teknik olarak zorlayıcı olan geleneksel saflaştırma adımlarını atlamaya yardımcı olur. Bakırın sitotoksisitesi nedeniyle, trans-siklooktan36 veya metil-tetrazin37'ye dayanan bakırsız tıklama kimyası da kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu reaktifler pahalıdır ve reaksiyonun regiospesifik olmayan38 doğası, ilgilenilen floresan etiketli proteinin düşük verimine neden olur.

Akış odası hazırlığından veri analizine kadar in vitro smFRET deneyleri için kapsamlı kılavuzlar burada sunulmuştur. SMFRET verileri bir TIRF kurulumu kullanılarak toplandı ve analiz özel olarak yazılmış bir MATLAB kodu kullanılarak gerçekleştirildi.

Birkaç önemli hususa dikkat edilmelidir. İlk olarak, PEG pasifleştirilmiş yüzeyin biyotin-PEG ile homojen ve daha az yoğun olması için hazırlanmalıdır. Aşırı biyotin-PEG, aşırı protein çekilmesine neden olabilir ve bu da tek tek moleküllerden gelen floresan sinyallerinin çözülmesini zorlaştırır. İkincisi, protein numunesi (hücre lizat süpernatant), yüzey doygunluğunu önlemek için numune odasına eklenmeden önce iyice seyreltilmelidir. Protein verimi hücre yoğunluğuna, tercih edilen deterjana ve deterjan konsantrasyonuna bağlıdır. Tek donör ve alıcı çiftlerinin sayısını optimize etmek için, 256 x 512 piksellik bir görüş alanında ~ 400 moleküllük bir yoğunluğu hedeflemelisiniz. Üçüncü olarak, Trolox tamponu uzun süreli kullanım için (aylar) -20 °C'de saklanmalıdır. Troloks tamponu, 4 °C'de saklandığında 2 hafta boyunca sabit kalır. Son olarak, antikor ile işlevselleştirildikten sonra akış odasına hava kabarcıkları girmemeye özen gösterilmelidir. Akış odasının kurutulması, protein immobilizasyonunun ve numune protein denatürasyonunun verimliliğinin azalmasına neden olacaktır.

Burada açıklanan mGluR2 sensörünün konformasyonel dinamikleri, smFRET kullanılarak bireysel reseptör seviyesinde başarıyla incelenmiş ve reseptör aktivasyon mekanizması hakkında fikir vermiştir. CRD'nin, glutamatın varlığına veya yokluğuna bakılmaksızın dört konformasyonel FRET durumu arasında bir dengede var olan yüksek düzeyde içsel dinamikler gösterdiği bulunmuştur. Daha yüksek FRET durumlarına veya daha kompakt bir reseptöre doğru bir kaymanın, glutamat konsantrasyonuna bağımlı bir şekilde meydana geldiği gösterilmiştir (Şekil 6). İlginç bir şekilde, doygun glutamat seviyelerinde bile, CRD dinamik kaldı. Konformasyonel dinamikleri anlamak için burada sunulan yöntem (Şekil 7'de özetlenmiştir), diğer C sınıfı GPCR'lerin yanı sıra iyon kanalları, iyonotropik reseptörler ve reseptör tirozin kinazları (RTK'lar) gibi diğer membran proteinlerine de uygulanabilir32,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Reza Vafabakhsh laboratuvarı üyelerine tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01GM140272 (R.V.'ye), Northwestern Üniversitesi'ndeki Yaşam Bilimleri için Searle Liderlik Fonu ve Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu tarafından Chicago Community Trust'taki Searle Funds'ın desteğiyle desteklenmiştir. B.W.L., Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) Eğitim Hibe T32GM-008061 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Tags

Biyokimya Sayı 186 G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) konformasyonel dinamikler membran reseptörleri doğal olmayan amino asitler smFRET
Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banerjee, C., Liauw, B. W. H.,… More

Banerjee, C., Liauw, B. W. H., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter