تصوير ماكرو مضان مدى الحياة للتطبيقات الطبية الحيوية
Summary
تصف هذه الورقة استخدام جهاز تصوير بصري جديد وسريع لتصوير عمر التلألؤ الضوئي العياني للعينات الباعثة للاضمحلال الطويل. يتم وصف إجراءات التكامل والحصول على الصور والتحليل ، جنبا إلى جنب مع إعداد وتوصيف مواد الاستشعار للتصوير وتطبيق التصوير في دراسة العينات البيولوجية.
Abstract
تقدم هذه الورقة جهاز تصوير جديد لمدى الحياة للتلألؤ الضوئي مصمم لرسم خريطة لتركيز الأكسجين الجزيئي (O 2) في عينات فسفورية مختلفة تتراوح من الطلاءات الصلبة الحساسة ل O 2 إلى عينات الأنسجة الحيوانية الحية الملطخة بمجسات حساسة O2 قابلة للذوبان. على وجه الخصوص ، تم استخدام مسبار الأشعة تحت الحمراء القريبة من الجسيمات النانوية NanO2-IR ، والذي يمكن استثارته باستخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء 625 نانومتر (LED) وينبعث عند 760 نانومتر. يعتمد نظام التصوير على كاميرا Timepix3 (Tpx3Cam) والمحول البصري الميكانيكي ، والذي يضم أيضا مكثفا للصورة. O2 الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للفسفور (PLIM) مطلوب بشكل شائع للدراسات المختلفة ، لكن المنصات الحالية لها قيود في دقتها ومرونتها العامة وسهولة استخدامها.
النظام المعروض هنا عبارة عن جهاز تصوير سريع وحساس للغاية ، وهو مبني على مستشعر بصري مدمج ووحدة رقاقة قراءة ، Tpx3Cam. يظهر أنه ينتج إشارات فسفرة عالية الكثافة وقيم عمر مستقرة من عينات الأنسجة المعوية الملطخة بالسطح أو الشظايا الملطخة داخل الأمعاء الغليظة ويسمح برسم خرائط مفصلة لمستويات الأنسجة O2 في حوالي 20 ثانية أو أقل. كما يتم تقديم التجارب الأولية على تصوير نقص الأكسجة في الأورام المطعمة في الحيوانات اللاواعية. نصف أيضا كيف يمكن إعادة تكوين جهاز التصوير للاستخدام مع المواد الحساسة O2 بناء على أصباغ Pt-porphyrin باستخدام مصباح LED 390 نانومتر للإثارة ومرشح تمرير النطاق 650 نانومتر للانبعاثات. بشكل عام ، وجد أن جهاز التصوير PLIM ينتج قياسات كمية دقيقة لقيم العمر للمجسات المستخدمة والخرائط ثنائية الأبعاد ذات الصلة لتركيز O2 . كما أنه مفيد للتصوير الأيضي لنماذج الأنسجة خارج الجسم الحي والحيوانات الحية.
Introduction
O 2 هو أحد المعلمات البيئية الرئيسية للأنظمة الحية ، ومعرفة توزيع O 2 وديناميكياته مهمة للعديد من الدراسات البيولوجية1،2،3. يكتسب تقييم أكسجة الأنسجة عن طريق المجسات الفسفورية4،5،6،7،8 و PLIM 9،10،11،12،13 شعبية في البحوث البيولوجية والطبية3،9،14،15،16 ، 17,18,19. وذلك لأن PLIM ، على عكس قياسات شدة التألق أو الفسفرة ، لا يتأثر بالعوامل الخارجية مثل تركيز المسبار ، والتبييض الضوئي ، وشدة الإثارة ، والمحاذاة البصرية ، والتشتت ، والتألق الذاتي.
ومع ذلك ، فإن منصات O2 PLIM الحالية محدودة بحساسيتها وسرعة التقاط الصور ودقتها وقابليتها للاستخدام بشكل عام. كثيرا ما يستخدم عد الفوتون المفرد المرتبط بالوقت (TCSPC) ، جنبا إلى جنب مع إجراء المسح النقطي ، في أجهزة PLIM والتصوير المجهري مدى الحياة (FLIM)20،21،22. ومع ذلك ، نظرا لأن PLIM يتطلب وقتا طويلا لبقاء البكسل (في نطاق ميلي ثانية) ، فإن وقت الحصول على الصور أطول بكثير مما هو مطلوب لتطبيقات FLIM20،22،23. تقنيات أخرى ، مثل كاميرات CCD / CMOS ذات البوابات ، تفتقر إلى حساسية الفوتون الفردي ولها معدلات إطارات منخفضة20،24،25،26. علاوة على ذلك ، تستخدم أنظمة PLIM الحالية في الغالب في الشكل المجهري ، في حين أن الأنظمة العيانية أقل شيوعا27.
تم إعداد جهاز تصوير الماكروPLIM 28 المستند إلى TCSPC للتغلب على العديد من هذه القيود. تم تسهيل تصميم جهاز التصوير إلى حد كبير من خلال استخدام محول ميكانيكي بصري جديد ، Cricket ، والذي يحتوي على ما يلي: ط) محولان C-mount ، يوفران سهولة اقتران وحدة الكاميرا على الجانب الخلفي والعدسة الموضوعية على الجانب الأمامي ؛ ب) مبيت داخلي لمكثف الصورة ومقبس طاقة للأخير على الجانب الخارجي من لعبة الكريكيت ؛ iii) مساحة داخلية خلف محول C-mount الأمامي حيث يمكن وضع مرشح انبعاث قياسي 25 مم أمام المكثف ؛ و iv) بصريات موازية للضوء مدمجة مع منظمات حلقية ، والتي تسمح بالمحاذاة / التركيز البصري بين العدسة والكاميرا لإنتاج صور واضحة على شريحة الكاميرا.
في جهاز التصوير المجمع ، تقترن وحدة الكاميرا بالجانب الخلفي من محول الكريكيت ، والذي يضم أيضا مكثفا للصورة يتكون من كاثود ضوئي متبوعا بلوحة قناة دقيقة (MCP) ، ومكبر للصوت ، وميض سريع ، فوسفور P47. تم تركيب مرشح انبعاث 760 نانومتر ± 50 نانومتر داخل لعبة الكريكيت ، وعدسة موضوعية ، NMV-50M11 ” ، متصلة بمحول C-mount الأمامي الجانبي. أخيرا ، يتم محاذاة العدسة والكاميرا بصريا مع منظمات الحلقة.
يتمثل دور المكثف في اكتشاف الفوتونات الواردة وتحويلها إلى رشقات نارية سريعة من الضوء على شريحة الكاميرا ، والتي يتم تسجيلها واستخدامها لتوليد اضمحلال الانبعاثات والصور مدى الحياة. تشتمل وحدة الكاميرا على مجموعة مستشعرات بصرية متقدمة قائمة على TCSPC (256 بكسل × 256 بكسل) وشريحة قراءة من الجيل الجديد29،30،31،32،33 ، والتي تسمح بالتسجيل المتزامن لوقت الوصول (TOA) والوقت فوق عتبة (TOT) من رشقات الفوتون في كل بكسل من رقاقة التصوير بدقة زمنية تبلغ 1.6 نانوثانية ومعدل قراءة 80 ميجابكسل / ثانية.
في هذا التكوين ، تتميز الكاميرا المزودة بالمكثف بحساسية فوتون واحد. إنه يعتمد على البيانات ويستند إلى نظام قراءة كاشف البكسل السريع (SPIDR)34. تميزت الدقة المكانية للتصوير سابقا بمستشعرات O2 الفسفورية المستوية وقناع لوحة الدقة. تم قياس وظيفة استجابة الجهاز (IRF) عن طريق تصوير مستشعر الفلورسنت المستوي تحت نفس الإعدادات المستخدمة في جميع القياسات الأخرى. كان عمر الصبغة البالغ حوالي 2.6 نانوثانية قصيرا بما يكفي لاستخدامه لقياس IRF في وضع PLIM. يمكن للتصوير تصوير كائنات يصل حجمها إلى 18 مم × 18 مم بدقة مكانية وزمانية تبلغ 39.4 ميكرومتر و 30.6 نانوثانية (العرض الكامل بنصف الحد الأقصى) ،على التوالي 28.
تصف البروتوكولات التالية تجميع جهاز تصوير الماكرو واستخدامه اللاحق لرسم خرائط تركيز O 2 في العينات البيولوجية الملطخة بمسبار O2 القريب من الأشعة تحت الحمراء ، NanO2-IR35. المسبار عبارة عن مسبار O2 ساطع وقابل للضوء ومنفذ للخلايا يعتمد على صبغة البلاتين (II) البنزوبورفيرين (PtBP). إنه مثير عند 625 نانومتر ، وينبعث عند 760 نانومتر ، ويوفر استجابة بصرية قوية ل O 2 في النطاق الفسيولوجي (0٪ -21٪ أو 0-210 ميكرومتر من O2). كما تم عرض جهاز التصوير لتوصيف مواد الاستشعار المختلفة بناء على أصباغ البورفيرين Pt (II). بشكل عام ، يكون جهاز التصوير مضغوطا ومرنا ، على غرار كاميرا التصوير الفوتوغرافي الشائعة. في الإعداد الحالي ، يكون جهاز التصوير مناسبا لتطبيقات PLIM واسعة المجال المختلفة. سيؤدي استبدال LED بمصدر ليزر سريع إلى زيادة تحسين أداء جهاز التصوير ويمكن أن يؤدي إلى تمكين تطبيقات FLIM نانوثانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم البروتوكولات المذكورة أعلاه وصفا تفصيليا لتجميع جهاز التصوير الجديد وتشغيله في وضع FLIM / PLIM بالميكروثانية. تنتج كاميرا Tpx3Cam من الجيل الجديد المستندة إلى TCSPC ، إلى جانب المحول البصري الميكانيكي Cricket مع مكثف الصورة ومرشح الانبعاثات وعدسة الماكرو ، وحدة بصرية مستقرة ومضغوطة ومرنة سهلة ال…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدعم المالي لهذا العمل من مؤسسة العلوم في أيرلندا ، والمنح SFI / 12 / RC / 2276_P2 و SFI / 17 / RC-PhD / 3484 و 18 / SP / 3522 ، وأبحاث السرطان الخارقة (علم الأورام الدقيق أيرلندا) معترف بها بامتنان.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
Riferimenti
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors – IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O’Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging – Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B., Becker, W. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. , 225-247 (2015).
- Becker, W., König, K. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. , 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. . Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).
