생물 의학 응용 분야를 위한 Fluorescence Lifetime Macro Imager
Summary
이 논문은 긴 붕괴 방출 샘플의 거시적 광발광 수명 이미징을 위한 새롭고 빠른 광학 이미저의 사용에 대해 설명합니다. 통합, 이미지 획득 및 분석 절차는 이미징을 위한 센서 재료의 준비 및 특성화와 생물학적 샘플 연구에서 이미저의 적용과 함께 설명됩니다.
Abstract
이 논문은 고체 상태의O2 민감성 코팅에서 용해성O2 민감성 프로브로 염색된 살아있는 동물 조직 샘플에 이르기까지 다양한 인광 샘플에서 분자 산소(O 2) 농도를 매핑하도록 설계된 새로운 광발광 수명 이미저를 제시합니다. 특히, 625nm 발광다이오드(LED)로 여기성이 있고 760nm에서 방출되는 나노입자 기반 근적외선 프로브 NanO2-IR을 사용하였다. 이미징 시스템은 Timepix3 카메라(Tpx3Cam)와 이미지 강화 장치도 있는 광학 기계식 어댑터를 기반으로 합니다. O2 인광 수명 이미징 현미경(PLIM)은 일반적으로 다양한 연구에 필요하지만 현재 플랫폼은 정확도, 일반적인 유연성 및 유용성에 한계가 있습니다.
여기에 제시된 시스템은 통합 광학 센서 및 판독 칩 모듈인 Tpx3Cam을 기반으로 하는 빠르고 고감도 이미저입니다. 표면 염색된 장 조직 샘플 또는 대장의 내강내 염색된 단편으로부터 고강도 인광 신호 및 안정적인 수명 값을 생성하는 것으로 나타났으며 약 20초 이내에 조직O2 수준의 상세한 매핑을 허용합니다. 무의식 동물에서 이식 된 종양에서 저산소증의 영상화에 대한 초기 실험도 제시된다. 또한 여기를 위한 390nm LED와 방출을 위한 대역통과 650nm 필터를 사용하여 Pt-포르피린 염료를 기반으로 하는 O2 민감성 물질과 함께 사용하도록 이미저를 재구성하는 방법에 대해서도 설명합니다. 전반적으로, PLIM 이미저는 사용된 프로브에 대한 수명 값의 정확한 정량적 측정과O2 농도의 각각의 2차원 맵을 생성하는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 생체 외 조직 모델 및 살아있는 동물의 대사 이미징에도 유용합니다.
Introduction
O 2 는 생명체에 대한 주요 환경 매개 변수 중 하나이며, O 2 의 분포와 그 역학에 대한 지식은 많은 생물학적 연구 1,2,3에서 중요합니다. 인광 프로브 4,5,6,7,8 및 PLIM 9,10,11,12,13에 의한 조직 산소화 평가는 생물학 및 의학 연구 3,9,14,15,16에서 인기를 얻고 있습니다. 17,18,19. 이는 PLIM이 형광 또는 인광 강도 측정과 달리 프로브 농도, 광표백, 여기 강도, 광학 정렬, 산란 및 자가형광과 같은 외부 요인의 영향을 받지 않기 때문입니다.
그러나 현재O2 PLIM 플랫폼은 감도, 이미지 획득 속도, 정확도 및 일반적인 사용성에 의해 제한됩니다. 래스터 스캐닝 절차와 결합된 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC)는 PLIM 및 형광 수명 이미징 현미경(FLIM) 장치(20,21,22)에서 자주 사용됩니다. 그러나, PLIM은 긴 픽셀 체류 시간(밀리초 범위에서)을 요구하기 때문에, 이미지 획득 시간은 FLIM 애플리케이션(20,22,23)에 요구되는 것보다 훨씬 더 긴다. 게이트 CCD/CMOS 카메라와 같은 다른 기술은 단일 광자 감도가 부족하고 낮은 프레임 속도(20,24,25,26)를 갖습니다. 또한, 기존의 PLIM 시스템은 대부분 현미경 형식으로 사용되는 반면, 거시적 시스템은 덜 일반적이다27.
TCSPC에 기초한 PLIM 매크로 이미저(28 )는 이러한 많은 한계들을 극복하기 위해 설정되었다. 이미 저의 설계는 다음과 같은 새로운 광기계식 어댑터 인 Cricket을 사용하여 크게 촉진되었습니다 : i) 후면의 카메라 모듈과 전면의 대물 렌즈를 쉽게 결합 할 수있는 2 개의 C- 마운트 어댑터; ii) 이미지 강화 장치용 내부 하우징 및 크리켓 바깥쪽에 있는 후자용 전원 소켓; iii) 표준 25mm 방출 필터를 증압기 앞에 수용할 수 있는 전면 C-마운트 어댑터 뒤의 내부 공간; 및 iv) 렌즈와 카메라 사이의 광학 정렬/초점을 허용하여 카메라 칩 상에 선명한 이미지를 생성할 수 있도록 하는 링 레귤레이터가 있는 내장형 광 시준 광학 장치.
조립된 이미저에서 카메라 모듈은 Cricket 어댑터의 뒷면에 연결되며, 여기에는 광음극, 마이크로 채널 플레이트(MCP), 증폭기 및 고속 신틸레이터인 P47 형광체로 구성된 이미지 강화 장치도 있습니다. 크리켓 내부에는 760nm ± 50nm 방출 필터가 장착되어 있으며 대물 렌즈인 NMV-50M11”이 전면 C-마운트 어댑터에 부착되어 있습니다. 마지막으로 렌즈와 카메라는 링 레귤레이터와 광학적으로 정렬됩니다.
증광기의 역할은 들어오는 광자를 감지하여 카메라 칩에서 빠른 빛의 폭발로 변환하여 등록하고 방출 감쇠 및 수명 이미지를 생성하는 데 사용하는 것입니다. 카메라 모듈은 고급 TCSPC 기반 광학 센서 어레이(256픽셀 x 256픽셀)와 차세대 판독 칩 29,30,31,32,33으로 구성되어 1.6ns의 시간 분해능과 80Mpixel/s 판독 속도로 이미징 칩의 각 픽셀에서 광자 버스트의 도착 시간(TOA) 및 임계값 초과 시간(TOT)을 동시에 기록할 수 있습니다.
이 구성에서 증압기가 있는 카메라는 단일 광자 감도를 갖습니다. 이는 데이터 구동형이며, 스피드 픽셀 검출기 판독(SPIDR) 시스템(34)에 기초한다. 이미 저의 공간 해상도는 이전에 평면 인광 O2 센서와 해상도 플레이트 마스크로 특성화되었습니다. 기기 응답 기능(IRF)은 다른 모든 측정에 사용된 것과 동일한 설정에서 평면 형광 센서의 이미징으로 측정되었습니다. 약 2.6ns의 염료 수명은 PLIM 모드에서 IRF 측정에 사용하기에 충분히 짧았습니다. 이미저는 각각 39.4μm 및 30.6ns(절반 최대에서 전체 너비)의 공간 및 시간 해상도로 최대 18mm x 18mm 크기의 물체를 이미지화할 수 있습니다(28).
다음 프로토콜은 이전에 특성화된 근적외선O2 프로브인 NanO2-IR35로 염색된 생물학적 샘플에서O2 농도를 매핑하기 위한 매크로 이미저의 조립 및 후속 사용을 설명합니다. 프로브는 백금(II) 벤조포르피린(PtBP) 염료를 기반으로 하는 밝고 광안정성이 있는 세포 투과성 O2 감지 프로브입니다. 625 nm에서 여기성이고, 760 nm에서 방출하며, 생리학적 범위(0%-21% 또는 0-210 μM의 O2)에서O2에 대한 강력한 광학 반응을 제공합니다. 이미저는 또한 Pt(II)-포르피린 염료를 기반으로 다양한 센서 재료를 특성화하는 것으로 입증되었습니다. 전반적으로 이미저는 일반적인 사진 카메라와 유사하게 작고 유연합니다. 현재 설정에서 이미저는 다양한 광시야 PLIM 애플리케이션에 적합합니다. LED를 빠른 레이저 소스로 대체하면 이미저의 성능이 더욱 향상되고 잠재적으로 나노초 FLIM 애플리케이션을 가능하게 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜은 새 이미저의 조립 및 마이크로초 FLIM/PLIM 모드에서의 작동에 대한 자세한 설명을 제공합니다. TCSPC 기반의 차세대 Tpx3Cam 카메라는 광기계식 어댑터 Cricket과 이미지 강화 장치, 방출 필터 및 매크로 렌즈를 통해 결합되어 작동하기 쉬운 안정적이고 컴팩트하며 유연한 광학 모듈을 생성합니다. 이미저는 인광 물질의 특성화 및 살아있는 조직 O2 이미징을 포함하는 다양한 샘?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Science Foundation Ireland, 보조금 SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 및 18/SP/3522, Breakthrough Cancer Research(Precision Oncology Ireland)의 이 작업에 대한 재정 지원에 감사드립니다.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
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