Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche
Summary
Questo articolo descrive l’uso di un nuovo imager ottico veloce per l’imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l’imaging e l’applicazione dell’imager nello studio dei campioni biologici.
Abstract
Questo articolo presenta un nuovo imager di durata della fotoluminescenza progettato per mappare la concentrazione di ossigeno molecolare (O 2) in diversi campioni fosforescenti che vanno dai rivestimenti sensibili allo stato solido, O 2 a campioni di tessuto animale vivo colorati con sonde solubili sensibili all’O2. In particolare, è stata utilizzata la sonda nel vicino infrarosso basata su nanoparticelle NanO2-IR, che è eccitabile con un diodo a emissione luminosa (LED) da 625 nm ed emette a 760 nm. Il sistema di imaging si basa sulla telecamera Timepix3 (Tpx3Cam) e sull’adattatore opto-meccanico, che ospita anche un intensificatore di immagine. La microscopia a vita di imaging con fosforescenza (PLIM) O2 è comunemente richiesta per vari studi, ma le piattaforme attuali hanno limitazioni nella loro accuratezza, flessibilità generale e usabilità.
Il sistema qui presentato è un imager veloce e altamente sensibile, costruito su un sensore ottico integrato e un modulo chip di lettura, Tpx3Cam. È dimostrato che produce segnali di fosforescenza ad alta intensità e valori stabili nel corso della vita da campioni di tessuto intestinale macchiati in superficie o frammenti di intestino crasso colorati per via intraluminale e consente la mappatura dettagliata dei livelli di O2 del tessuto in circa 20 s o meno. Vengono inoltre presentati esperimenti iniziali sull’imaging dell’ipossia nei tumori innestati in animali incoscienti. Descriviamo anche come l’imager può essere riconfigurato per l’uso con materiali sensibili all’O2 basati su coloranti Pt-porfirina utilizzando un LED da 390 nm per l’eccitazione e un filtro passa banda 650 nm per l’emissione. Nel complesso, l’imager PLIM è risultato in grado di produrre misurazioni quantitative accurate dei valori di vita per le sonde utilizzate e le rispettive mappe bidimensionali della concentrazione di O2 . È anche utile per l’imaging metabolico di modelli di tessuto ex vivo e animali vivi.
Introduction
O 2 è uno dei parametri ambientali chiave per i sistemi viventi e la conoscenza della distribuzione di O 2 e della sua dinamica è importante per molti studi biologici 1,2,3. La valutazione dell’ossigenazione tissutale mediante sonde fosforescenti 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 sta guadagnando popolarità nella ricerca biologica e medica 3,9,14,15,16, 17,18,19. Questo perché il PLIM, a differenza delle misurazioni dell’intensità di fluorescenza o fosforescenza, non è influenzato da fattori esterni come la concentrazione della sonda, il fotosbiancamento, l’intensità di eccitazione, l’allineamento ottico, la diffusione e l’autofluorescenza.
Tuttavia, le attuali piattaforme PLIM O2 sono limitate dalla loro sensibilità, velocità di acquisizione delle immagini, precisione e usabilità generale. Il conteggio a singolo fotone correlato al tempo (TCSPC), combinato con una procedura di scansione raster, viene spesso utilizzato nei dispositivi PLIM e FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)20,21,22. Tuttavia, poiché PLIM richiede un lungo tempo di permanenza dei pixel (nell’intervallo dei millisecondi), il tempo di acquisizione dell’immagine è molto più lungo di quello richiesto per le applicazioni FLIM20,22,23. Altre tecniche, come le telecamere CCD / CMOS gated, mancano di sensibilità a singolo fotone e hanno frame rate bassi20,24,25,26. Inoltre, i sistemi PLIM esistenti sono per lo più utilizzati nel formato microscopico, mentre i sistemi macroscopici sono meno comuni27.
Il sequencer macro imager28 basato su TCSPC è stato configurato per superare molte di queste limitazioni. Il design dell’imager è stato notevolmente facilitato dall’uso di un nuovo adattatore opto-meccanico, Cricket, che ha quanto segue: i) due adattatori C-mount, che forniscono un facile accoppiamento del modulo fotocamera sul lato posteriore e dell’obiettivo sul lato anteriore; ii) un alloggiamento interno per un intensificatore di immagine e una presa di corrente per quest’ultimo sul lato esterno del Cricket; iii) uno spazio interno dietro l’adattatore frontale con montaggio a C in cui un filtro di emissione standard da 25 mm può essere alloggiato davanti all’intensificatore; e iv) un’ottica di collimazione della luce incorporata con regolatori ad anello, che consentono l’allineamento / messa a fuoco ottica tra l’obiettivo e la fotocamera per produrre immagini nitide sul chip della fotocamera.
Nell’imager assemblato, il modulo della fotocamera è accoppiato al lato posteriore dell’adattatore Cricket, che ospita anche un intensificatore di immagine costituito da un fotocatodo seguito da una piastra a microcanali (MCP), un amplificatore e uno scintillatore veloce, il fosforo P47. Un filtro di emissione da 760 nm ± 50 nm è montato all’interno del Cricket e un obiettivo, NMV-50M11”, è collegato all’adattatore C-mount frontale. Infine, l’obiettivo e la fotocamera sono allineati otticamente con i regolatori ad anello.
Il ruolo dell’intensificatore è quello di rilevare i fotoni in arrivo e convertirli in rapide esplosioni di luce sul chip della fotocamera, che vengono registrati e utilizzati per generare decadimenti di emissione e immagini a vita. Il modulo telecamera comprende un avanzato array di sensori ottici basati su TCSPC (256 pixel x 256 pixel) e un chip di lettura di nuova generazione 29,30,31,32,33, che consentono la registrazione simultanea del tempo di arrivo (TOA) e del tempo oltre la soglia (TOT) dei burst di fotoni su ciascun pixel del chip di imaging con una risoluzione temporale di 1,6 ns e una velocità di lettura di 80 Mpixel/s.
In questa configurazione, la telecamera con l’intensificatore ha una sensibilità a fotone singolo. È basato sui dati e si basa sul sistema di lettura del rilevatore di pixel veloci (SPIDR)34. La risoluzione spaziale dell’imager era precedentemente caratterizzata da sensori O2 fosforescenti planari e una maschera a piastre di risoluzione. La funzione di risposta dello strumento (IRF) è stata misurata mediante l’imaging di un sensore fluorescente planare con le stesse impostazioni utilizzate per tutte le altre misurazioni. La durata del colorante di circa 2,6 ns è stata abbastanza breve da poter essere utilizzata per la misurazione IRF in modalità PLIM. L’imager può visualizzare oggetti di dimensioni fino a 18 mm x 18 mm con risoluzioni spaziali e temporali di 39,4 μm e 30,6 ns (larghezza completa a metà massima), rispettivamente28.
I seguenti protocolli descrivono l’assemblaggio del macro imager e il suo successivo utilizzo per mappare la concentrazione di O 2 in campioni biologici colorati con la sonda O2 nel vicino infrarosso precedentemente caratterizzata, NanO2-IR35. La sonda è una sonda O2 luminosa, fotostabile, permeabile alle cellule basata sul colorante benzoporfirina di platino (II) (PtBP). È eccitabile a 625 nm, emette a 760 nm e fornisce una robusta risposta ottica a O 2 nell’intervallo fisiologico (0% -21% o 0-210 μM di O2). È stato inoltre dimostrato che l’imager caratterizza diversi materiali del sensore basati su coloranti Pt(II)-porfirina. Nel complesso, l’imager è compatto e flessibile, simile a una comune fotocamera fotografica. Nella configurazione corrente, l’imager è adatto per diverse applicazioni PLIM a campo ampio. La sostituzione del LED con una sorgente laser veloce migliorerà ulteriormente le prestazioni dell’imager e potrebbe potenzialmente consentire applicazioni FLIM in nanosecondi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli di cui sopra forniscono una descrizione dettagliata dell’assemblaggio del nuovo imager e del suo funzionamento in modalità FLIM/PLIM al microsecondo. La telecamera Tpx3Cam di nuova generazione basata su TCSPC, accoppiata mediante l’adattatore optomeccanico Cricket con l’intensificatore di immagine, il filtro di emissione e il macroobiettivo, produce un modulo ottico stabile, compatto e flessibile facile da usare. L’imager ha dimostrato di funzionare bene con una serie di diversi campioni e compiti analitici…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno finanziario per questo lavoro da parte della Science Foundation Ireland, sovvenzioni SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 e 18 / SP / 3522, e Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) è riconosciuto con gratitudine.
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
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