बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए फ्लोरेसेंस लाइफटाइम मैक्रो इमेजर
Summary
यह पेपर लंबे क्षय उत्सर्जक नमूनों के मैक्रोस्कोपिक फोटोलुमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग के लिए एक नए, तेज ऑप्टिकल इमेजर के उपयोग का वर्णन करता है। इमेजिंग के लिए सेंसर सामग्री की तैयारी और लक्षण वर्णन और जैविक नमूनों का अध्ययन करने में इमेजर के आवेदन के साथ एकीकरण, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है।
Abstract
यह पेपर एक नया फोटोलुमिनेसेंस लाइफटाइम इमेजर प्रस्तुत करता है जो ठोस अवस्था, ओ 2-संवेदनशील कोटिंग्स से लेकर घुलनशील ओ 2-संवेदनशील जांच से सना जीवित पशु ऊतक के नमूनों तक विभिन्न फॉस्फोरेसेंट नमूनों में आणविक ऑक्सीजन (ओ2) एकाग्रता को मैप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। विशेष रूप से, नैनोपार्टिकल-आधारित नियर-इन्फ्रारेड प्रोब नैनोओ 2-आईआर, जो 625 एनएम प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) के साथ उत्तेजित है और 760 एनएम पर उत्सर्जित होता है, का उपयोग किया गया था। इमेजिंग सिस्टम टाइमपिक्स 3 कैमरा (टीपीएक्स 3 कैम) और ऑप्टो-मैकेनिकल एडाप्टर पर आधारित है, जिसमें एक इमेज इंटेंसिफायर भी है। ओ2 फॉस्फोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (पीएलआईएम) आमतौर पर विभिन्न अध्ययनों के लिए आवश्यक है, लेकिन वर्तमान प्लेटफार्मों में उनकी सटीकता, सामान्य लचीलापन और प्रयोज्यता में सीमाएं हैं।
यहां प्रस्तुत प्रणाली एक तेज और अत्यधिक संवेदनशील इमेजर है, जिसे एक एकीकृत ऑप्टिकल सेंसर और रीडआउट चिप मॉड्यूल, टीपीएक्स 3 कैम पर बनाया गया है। यह सतह से सना आंतों के ऊतक के नमूनों या बड़ी आंत के इंट्राल्यूमिनल रूप से दाग वाले टुकड़ों से उच्च तीव्रता वाले फॉस्फोरेसेंस संकेतों और स्थिर जीवनकाल मूल्यों का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है और लगभग 20 सेकंड या उससे कम में ऊतक ओ2 स्तरों के विस्तृत मानचित्रण की अनुमति देता है। बेहोश जानवरों में ग्राफ्टेड ट्यूमर में हाइपोक्सिया की इमेजिंग पर प्रारंभिक प्रयोग भी प्रस्तुत किए गए हैं। हम यह भी वर्णन करते हैं कि इमेजर को उत्तेजना के लिए 390 एनएम एलईडी और उत्सर्जन के लिए बैंडपास 650 एनएम फिल्टर का उपयोग करके पीटी-पोर्फिरीन रंगों पर आधारित ओ2-संवेदनशील सामग्री के साथ उपयोग के लिए फिर से कॉन्फ़िगर किया जा सकता है। कुल मिलाकर, पीएलआईएम इमेजर को उपयोग की जाने वाली जांच के लिए जीवनकाल मूल्यों के सटीक मात्रात्मक माप और ओ2 एकाग्रता के संबंधित दो-आयामी मानचित्रों का उत्पादन करने के लिए पाया गया था। यह पूर्व विवो ऊतक मॉडल और जीवित जानवरों के चयापचय इमेजिंग के लिए भी उपयोगी है।
Introduction
ओ 2 जीवित प्रणालियों के लिए प्रमुख पर्यावरणीय मापदंडों में से एक है, और ओ 2 के वितरण और इसकी गतिशीलता का ज्ञान कई जैविक अध्ययनों 1,2,3 के लिए महत्वपूर्ण है। फॉस्फोरेसेंट प्रोब 4,5,6,7,8 और पीएलआईएम 9,10,11,12,13 के माध्यम से ऊतक ऑक्सीकरण का आकलन जैविक और चिकित्सा अनुसंधान 3,9,14,15,16 में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है। 17,18,19. ऐसा इसलिए है क्योंकि पीएलआईएम, प्रतिदीप्ति या फॉस्फोरेसेंस तीव्रता माप के विपरीत, बाहरी कारकों जैसे जांच एकाग्रता, फोटोब्लीचिंग, उत्तेजना तीव्रता, ऑप्टिकल संरेखण, प्रकीर्णन और ऑटोफ्लोरेसेंस से प्रभावित नहीं होता है।
हालांकि, वर्तमान ओ2 पीएलआईएम प्लेटफॉर्म उनकी संवेदनशीलता, छवि अधिग्रहण गति, सटीकता और सामान्य प्रयोज्यता से सीमित हैं। समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती (टीसीएसपीसी), एक रास्टर स्कैनिंग प्रक्रिया के साथ संयुक्त, अक्सर पीएलआईएम और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एफएलआईएम) उपकरणों20,21,22 में उपयोग किया जाता है। हालांकि, चूंकि पीएलआईएम को एक लंबे पिक्सेल निवास समय (मिलीसेकंड रेंज में) की आवश्यकता होती है, इसलिए छवि अधिग्रहण का समय एफएलआईएम अनुप्रयोगों20,22,23 के लिए आवश्यक समय से बहुत लंबा है। सीएमओएस कैमरों जैसी अन्य तकनीकों में एकल फोटॉन संवेदनशीलता की कमी होती है और कम फ्रेम दर20,24,25,26 होती है। इसके अलावा, मौजूदा पीएलआईएम सिस्टम ज्यादातर सूक्ष्म प्रारूप में उपयोग किए जाते हैं, जबकि मैक्रोस्कोपिक सिस्टमकम आम हैं।
टीसीएसपीसी आधारित पीएलआईएम मैक्रो इमेजर28 को इनमें से कई सीमाओं को दूर करने के लिए स्थापित किया गया था। इमेजर के डिजाइन को एक नए ऑप्टो-मैकेनिकल एडाप्टर, क्रिकेट के उपयोग से बहुत सुविधाजनक बनाया गया था, जिसमें निम्नलिखित हैं: i) दो सी-माउंट एडेप्टर, जो पीछे की तरफ कैमरा मॉड्यूल और सामने की तरफ उद्देश्य लेंस का आसान युग्मन प्रदान करते हैं; (ii) क्रिकेट के बाहरी हिस्से में एक छवि गहनता के लिए एक आंतरिक आवास और उत्तरार्द्ध के लिए एक पावर सॉकेट; iii) फ्रंट-साइड सी-माउंट एडाप्टर के पीछे एक आंतरिक स्थान जहां एक मानक 25 मिमी उत्सर्जन फिल्टर को इंटेंसिफायर के सामने रखा जा सकता है; और iv) रिंग नियामकों के साथ एक अंतर्निहित प्रकाश कोलिमेटिंग ऑप्टिक्स, जो कैमरा चिप पर कुरकुरा छवियों का उत्पादन करने के लिए लेंस और कैमरे के बीच ऑप्टिकल संरेखण / ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है।
इकट्ठे इमेजर में, कैमरा मॉड्यूल को क्रिकेट एडाप्टर के पीछे की तरफ युग्मित किया गया है, जिसमें एक फोटोकैथोड से युक्त एक इमेज इंटेंसिफायर भी है, जिसके बाद एक माइक्रोचैनल प्लेट (एमसीपी), एक एम्पलीफायर और एक तेज सिंटिलेटर, पी 47 फॉस्फोर है। क्रिकेट के अंदर 760 एनएम ± 50 एनएम उत्सर्जन फिल्टर फिट किया गया है, और एक उद्देश्य लेंस, एनएमवी -50 एम 11′, फ्रंट साइड सी-माउंट एडाप्टर से जुड़ा हुआ है। अंत में, लेंस और कैमरा रिंग नियामकों के साथ ऑप्टिकल रूप से संरेखित होते हैं।
इंटेंसिफायर की भूमिका आने वाले फोटॉनों का पता लगाना और उन्हें कैमरा चिप पर प्रकाश के तेज विस्फोट में परिवर्तित करना है, जो पंजीकृत हैं और उत्सर्जन क्षय और आजीवन छवियों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। कैमरा मॉड्यूल में एक उन्नत टीसीएसपीसी-आधारित ऑप्टिकल सेंसर सरणी (256 पिक्सेल x 256 पिक्सल) और एक नई पीढ़ी की रीडआउट चिप 29,30,31,32,33 शामिल है, जो 1.6 एनएस के समय रिज़ॉल्यूशन और 80 एमपिक्सेल / सेकंड रीडआउट दर के साथ इमेजिंग चिप के प्रत्येक पिक्सेल पर फोटॉन के आगमन के समय (टीओए) और टाइम ओवर थ्रेशोल्ड (टीओटी) की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है।
इस कॉन्फ़िगरेशन में, इंटेंसिफायर वाले कैमरे में सिंगल-फोटॉन संवेदनशीलता होती है। यह डेटा-संचालित है और त्वरित पिक्सेल डिटेक्टर रीडआउट (एसपीआईडीआर) सिस्टम34 पर आधारित है। इमेजर के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को पहले प्लानर फॉस्फोरेसेंट ओ2 सेंसर और एक रिज़ॉल्यूशन प्लेट मास्क के साथ चित्रित किया गया था। इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) को अन्य सभी मापों के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स के तहत एक प्लानर फ्लोरोसेंट सेंसर की इमेजिंग द्वारा मापा गया था। लगभग 2.6 एनएस की डाई का जीवनकाल पीएलआईएम मोड में आईआरएफ माप के लिए उपयोग किए जाने के लिए पर्याप्त छोटा था। इमेजर क्रमशः 39.4 μm और 30.6 ns (आधे-अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई) के स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ आकार में 18 मिमी x 18 मिमी तक की वस्तुओं की छवि बना सकताहै।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल मैक्रो इमेजर की असेंबली और जैविक नमूनों में ओ 2 एकाग्रता के मानचित्रण के लिए इसके बाद के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो पहले से विशेषता वाले निकट-अवरक्त ओ 2 जांच, नैनोओ2-आईआर 35 के साथ सना हुआ है। जांच प्लैटिनम (II) बेंजोपोरफाइरिन (पीटीबीपी) डाई पर आधारित एक उज्ज्वल, फोटोस्टेबल, सेल-पारगम्य ओ2-सेंसिंग जांच है। यह 625 एनएम पर उत्तेजित है, 760 एनएम पर उत्सर्जन करता है, और शारीरिक सीमा (ओ2 के 0% -21% या 0-210 μM) मेंO2 के लिए एक मजबूत ऑप्टिकल प्रतिक्रिया प्रदान करता है। इमेजर को पीटी (II) -पोर्फिरीन रंगों के आधार पर विभिन्न सेंसर सामग्रियों को चिह्नित करने के लिए भी प्रदर्शित किया जाता है। कुल मिलाकर, इमेजर कॉम्पैक्ट और लचीला है, एक आम फोटोग्राफिक कैमरे के समान। वर्तमान सेटअप में, इमेजर विभिन्न वाइडफील्ड पीएलआईएम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। एक तेज लेजर स्रोत के साथ एलईडी को प्रतिस्थापित करने से इमेजर के प्रदर्शन में और सुधार होगा और संभावित रूप से नैनोसेकंड एफएलआईएम अनुप्रयोगों को सक्षम किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपरोक्त प्रोटोकॉल नए इमेजर की असेंबली और माइक्रोसेकंड एफएलआईएम / पीएलआईएम मोड में इसके संचालन का विस्तृत विवरण देते हैं। टीसीएसपीसी-आधारित नई पीढ़ी का टीपीएक्स 3 कैम कैमरा, छवि तीव्र, उत्सर्जन फिल्टर …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
साइंस फाउंडेशन आयरलैंड से इस काम के लिए वित्तीय सहायता, एसएफआई/12/आरसी/2276_P2, एसएफआई/17/आरसी-पीएचडी/3484 और 18/एसपी/3522 और ब्रेकथ्रू कैंसर रिसर्च (प्रेसिजन ऑन्कोलॉजी आयरलैंड) को कृतज्ञता पूर्वक स्वीकार किया जाता है।
Materials
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
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