Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms

Summary

Das vorliegende Protokoll etabliert und charakterisiert ein patientenabgeleitetes Xenotransplantat-Modell (PDX) für anaplastisches Schilddrüsenkarzinom (ATC) und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC), da PDX-Modelle schnell zum Standard im Bereich der translationalen Onkologie werden.

Abstract

Patient-derived xenograft (PDX)-Modelle bewahren die histologischen und genetischen Merkmale des Primärtumors und bewahren seine Heterogenität. Pharmakodynamische Ergebnisse, die auf PDX-Modellen basieren, korrelieren stark mit der klinischen Praxis. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist die bösartigste Subform des Schilddrüsenkarzinoms mit starker Invasivität, schlechter Prognose und begrenzter Behandlung. Obwohl die Inzidenzrate von ATC nur 2%-5% des Schilddrüsenkrebses ausmacht, liegt die Sterblichkeitsrate bei 15%-50%. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist mit über 600.000 Neuerkrankungen weltweit eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen des Kopfes und Halses. Im Folgenden werden detaillierte Protokolle vorgestellt, um PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu erstellen. In dieser Arbeit wurden die Schlüsselfaktoren, die die Erfolgsrate der Modellkonstruktion beeinflussen, analysiert und die histopathologischen Merkmale zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Darüber hinaus wurde die klinische Relevanz des Modells validiert, indem die in vivo therapeutische Wirksamkeit repräsentativer klinisch eingesetzter Medikamente in den erfolgreich konstruierten PDX-Modellen evaluiert wurde.

Introduction

Das PDX-Modell ist ein Tiermodell, bei dem menschliches Tumorgewebe in immundefiziente Mäuse transplantiert wird und in der von den Mäusen bereitgestellten Umgebung wächst¹. Herkömmliche Tumorzelllinienmodelle leiden unter mehreren Nachteilen, wie z. B. der mangelnden Heterogenität, der Unfähigkeit, die Tumormikroumgebung zu erhalten, der Anfälligkeit für genetische Variationen während wiederholter In-vitro-Passagen und der schlechten klinischen Anwendung ^2,3. Die Hauptnachteile gentechnisch veränderter Tiermodelle sind der potenzielle Verlust der genomischen Merkmale menschlicher Tumore, die Einführung neuer unbekannter Mutationen und die Schwierigkeit, den Grad der Homologie zwischen Maustumoren und menschlichen Tumoren zu bestimmen⁴. Hinzu kommt, dass die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodelle teuer, zeitaufwendig und relativ ineffizient ist⁴.

Das PDX-Modell hat gegenüber anderen Tumormodellen viele Vorteile in Bezug auf die Widerspiegelung der Tumorheterogenität. Aus histopathologischer Sicht ersetzt das Maus-Pendant zwar im Laufe der Zeit das menschliche Stroma, aber das PDX-Modell bewahrt die morphologische Struktur des Primärtumors gut. Darüber hinaus bewahrt das PDX-Modell die metabolomische Identität des Primärtumors für mindestens vier Generationen und spiegelt die komplexen Wechselbeziehungen zwischen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung besser wider, was es einzigartig in der Simulation von Wachstum, Metastasierung, Angiogenese und Immunsuppression von menschlichem Tumorgewebe macht ^5,6,7. Auf zellulärer und molekularer Ebene spiegelt das PDX-Modell die Heterogenität zwischen und innerhalb des Tumors menschlicher Tumore sowie die phänotypischen und molekularen Merkmale des ursprünglichen Krebses genau wider, einschließlich Genexpressionsmuster, Mutationsstatus, Kopienzahl sowie DNA-Methylierung und Proteomik ^8,9. PDX-Modelle mit unterschiedlichen Passagen weisen die gleiche Sensitivität gegenüber medikamentöser Therapie auf, was darauf hindeutet, dass die Genexpression von PDX-Modellen sehr stabil ist^10,11. Studien haben eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem Ansprechen des PDX-Modells auf ein Medikament und dem klinischen Ansprechen der Patienten auf dieses Medikament gezeigt^12,13. Daher hat sich das PDX-Modell zu einem leistungsstarken präklinischen und translationalen Forschungsmodell entwickelt, insbesondere für das Wirkstoffscreening und die Vorhersage klinischer Prognosen.

Schilddrüsenkrebs ist ein häufiger bösartiger Tumor des endokrinen Systems und eine bösartige Erkrankung des Menschen, deren Inzidenz in den letzten Jahren rapide zugenommen hat¹⁴. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist mit einer medianen Überlebenszeit von nur 4,8 Monaten der bösartigste Schilddrüsenkrebs¹⁵. Obwohl in China jedes Jahr nur bei einer Minderheit der Schilddrüsenkrebspatienten ATC diagnostiziert wird, liegt die Sterblichkeitsrate bei fast 100 %16,17,18. ATC wächst in der Regel schnell und dringt in das angrenzende Gewebe des Halses sowie in die zervikalen Lymphknoten ein, und etwa die Hälfte der Patienten hat Fernmetastasen^19,20. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist die sechsthäufigste Krebserkrankung der Welt und eine der häufigsten Krebstodesursachen, wobei jedes Jahr schätzungsweise 600.000 Menschen an HNSCC erkranken^21,22,23. Das HNSCC umfasst eine große Anzahl von Tumoren, darunter solche in der Nase, den Nasennebenhöhlen, dem Mund, den Mandeln, dem Rachen und dem Kehlkopf²⁴. ATC und HNSCC sind zwei der wichtigsten Malignome von Kopf und Hals. Um die Entwicklung neuartiger Therapeutika und personalisierter Behandlungen zu erleichtern, ist es notwendig, robuste und fortschrittliche präklinische Tiermodelle wie PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu entwickeln.

In diesem Artikel werden detaillierte Methoden zur Etablierung des subkutanen PDX-Modells von ATC und HNSCC vorgestellt, die Schlüsselfaktoren analysiert, die die Tumoraufnahmerate in der Modellkonstruktion beeinflussen, und die histopathologischen Charakteristika zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Währenddessen wurden in vivo pharmakodynamische Tests unter Verwendung der erfolgreich konstruierten PDX-Modelle durchgeführt, um deren klinische Relevanz zu validieren.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des West China Hospital der Universität Sichuan genehmigt wurden. Für die vorliegende Studie wurden immundefiziente NOD-SCID-Mäuse im Alter von 4-6 Wochen (beiderlei Geschlechts) und weibliche Balb/c-Nacktmäuse im Alter von 4-6 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezog…

Representative Results

Insgesamt wurden 18 Schilddrüsenkrebsproben transplantiert und fünf PDX-Modelle für Schilddrüsenkrebs erfolgreich konstruiert (27,8 % Tumorentnahmerate), darunter vier Fälle von undifferenziertem Schilddrüsenkrebs und ein Fall von anaplastischem Schilddrüsenkrebs. Der Zusammenhang zwischen der Erfolgsrate der Modellkonstruktion und dem Alter, dem Geschlecht, dem Tumordurchmesser, dem Tumorgrad und der Differenzierung wurde analysiert. Obwohl die Modellerfolgsrate von Tumorproben Grad 4 höher war als bei Proben mi…

Discussion

In dieser Studie konnten die subkutanen PDX-Modelle von ATC und HNSCC erfolgreich etabliert werden. Es gibt viele Aspekte, auf die beim Bau von PDX-Modellen geachtet werden muss. Wenn das Tumorgewebe vom Patienten getrennt wird, sollte es so schnell wie möglich in die Eisbox gelegt und zur Impfung ins Labor geschickt werden. Nachdem der Tumor im Labor angekommen ist, muss der Bediener auf die Aufrechterhaltung eines sterilen Feldes achten und aseptische Verfahren anwenden. Da das Tumorgewebe bei Nadelbiopsieproben beson…

Materials

2.4 mm x 2.0 mm trocar	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-9065
Balb/c nude mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	401
Biosafety cabinet	Suzhou Antai	BSC-1300IIA2
Blade	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0823
Centrifuge tube	Corning	430791/430829
Cryopreservation tube	Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd	/
Custodiol HTK-Solution	Custodiol	2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	SIGMA-ALORICH	D5879-500mL
Electronic balance	METTLER	ME104
Electronic digital caliper	Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd	0-220
fetal bovine serum(FBS)	VivaCell	C04001-500
IBM SPSS Statistics 26	IBM
Ketamine	Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd	100761663
Lenvatinib	ApexBio	A2174
NOD SCID immunodeficient mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	406
Pen-Strep Solution	Biological Industries	03-03101BCS
Petri dish	WHB	WHB-60/WHB-100
Saline	Sichuan Kelun	W220051705
Scissor	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0110
Tweezer	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-1241
Vet ointment	Pfizer Inc.	P10015353
Xylazine	Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd	070031777