Estabelecimento e Caracterização de Modelos de Xenoenxerto Derivado de Pacientes de Carcinoma Anaplásico de Tireoide e Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço

Summary

O presente protocolo estabelece e caracteriza um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) e carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP), uma vez que os modelos PDX estão rapidamente se tornando o padrão no campo da oncologia translacional.

Abstract

Os modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) preservam fielmente as características histológicas e genéticas do tumor primário e mantêm sua heterogeneidade. Os resultados farmacodinâmicos baseados em modelos PDX são altamente correlacionados com a prática clínica. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o subtipo mais maligno de câncer de tireoide, com forte invasividade, prognóstico ruim e tratamento limitado. Embora a taxa de incidência de ATC seja responsável por apenas 2%-5% do câncer de tireoide, sua taxa de mortalidade é tão alta quanto 15%-50%. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é uma das neoplasias malignas mais comuns de cabeça e pescoço, com mais de 600.000 novos casos em todo o mundo a cada ano. Neste trabalho, são apresentados protocolos detalhados para estabelecer modelos PDX de ATC e CECP. Neste trabalho, os principais fatores que influenciam a taxa de sucesso de construção do modelo foram analisados, e as características histopatológicas foram comparadas entre o modelo PDX e o tumor primário. Além disso, a relevância clínica do modelo foi validada pela avaliação da eficácia terapêutica in vivo de fármacos representativos de uso clínico nos modelos PDX construídos com sucesso.

Introduction

O modelo PDX é um modelo animal no qual o tecido tumoral humano é transplantado em camundongos imunodeficientes e cresce no ambiente fornecido pelos camundongos¹. Os modelos tradicionais de linhagens celulares tumorais sofrem de várias desvantagens, como a falta de heterogeneidade, a incapacidade de reter o microambiente tumoral, a vulnerabilidade a variações genéticas durante repetidas passagens in vitro e a pobre aplicação^clínica2,3. As principais desvantagens dos modelos animais geneticamente modificados são a perda potencial das características genômicas dos tumores humanos, a introdução de novas mutações desconhecidas e a dificuldade em identificar o grau de homologia entre tumores de camundongos e tumores^humanos4. Além disso, a preparação de modelos animais geneticamente modificados é cara, demorada e relativamente ineficiente⁴.

O modelo PDX tem muitas vantagens sobre outros modelos tumorais em termos de refletir a heterogeneidade tumoral. Do ponto de vista histopatológico, embora a contraparte do camundongo substitua o estroma humano ao longo do tempo, o modelo PDX preserva bem a estrutura morfológica do tumor primário. Além disso, o modelo PDX conserva a identidade metabolômica do tumor primário por pelo menos quatro gerações e reflete melhor as complexas inter-relações entre as células tumorais e seu microambiente, tornando-o único na simulação do crescimento, metástase, angiogênese e imunossupressão do tecido tumoral^humano5,6,7. Em nível celular e molecular, o modelo PDX reflete com precisão a heterogeneidade inter e intratumoral de tumores humanos, bem como as características fenotípicas e moleculares do câncer original, incluindo padrões de expressão gênica, status de mutação, número de cópias, metilação e proteômica do DNA ^8,9. Modelos PDX com passagens diferentes têm a mesma sensibilidade à terapia medicamentosa, indicando que a expressão gênica de modelos PDX é altamente estável^10,11. Estudos têm demonstrado excelente correlação entre a resposta do modelo PDX a um fármaco e as respostas clínicas dos pacientes a esse fármaco^12,13. Portanto, o modelo PDX emergiu como um poderoso modelo de pesquisa pré-clínica e translacional, particularmente para triagem de drogas e predição de prognóstico clínico.

O câncer de tireoide é um tumor maligno comum do sistema endócrino e é uma neoplasia maligna humana que tem mostrado um rápido aumento na incidência nos últimos^anos14. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o câncer mais maligno da tireoide, com sobrevida mediana de apenas 4,8^meses15. Embora apenas uma minoria dos pacientes com câncer de tireoide seja diagnosticada com ATC a cada ano na China, a taxa de mortalidade é próxima de 100%^16,17,18. A ATC geralmente cresce rapidamente e invade os tecidos adjacentes do pescoço, bem como os linfonodos cervicais, e cerca de metade dos pacientes apresenta metástases à^{distância19,20}. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto câncer mais comum no mundo e uma das principais causas de morte por câncer, estimando-se que 600.000 pessoas sofram de CEC de cabeça e pescoço a cada ano^21,22,23. O CEC de cabeça e pescoço inclui um grande número de tumores, incluindo nariz, seios da face, boca, amígdalas, faringe e laringe²⁴. ATC e CEC de cabeça e pescoço são duas das principais neoplasias malignas de cabeça e pescoço. Para facilitar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos personalizados, é necessário desenvolver modelos animais pré-clínicos robustos e avançados, como os modelos PDX de ATC e HNSCC.

Este artigo apresenta métodos detalhados para estabelecer o modelo PDX subcutâneo de ATC e CEC de cabeça e pescoço, analisa os principais fatores que afetam a taxa de tomada tumoral na construção do modelo e compara as características histopatológicas entre o modelo PDX e o tumor primário. Enquanto isso, neste trabalho, testes farmacodinâmicos in vivo foram realizados utilizando os modelos PDX construídos com sucesso para validar sua relevância clínica.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do West China Hospital, Sichuan University. Camundongos imunodeficientes NOD-SCID com idade entre 4-6 semanas de idade (de ambos os sexos) e camundongos fêmeas Balb/c nude com idade entre 4-6 semanas foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver <strong…

Representative Results

Um total de 18 espécimes de câncer de tireoide foram transplantados, e cinco modelos PDX de câncer de tireoide foram construídos com sucesso (taxa de tomada tumoral de 27,8%), incluindo quatro casos de câncer indiferenciado de tireoide e um caso de câncer anaplásico de tireoide. A correlação entre a taxa de sucesso de construção do modelo e a idade, sexo, diâmetro do tumor, grau e diferenciação tumoral foram analisadas. Embora a taxa de sucesso do modelo de amostras tumorais de grau 4 tenha sido maior do qu…

Discussion

Este estudo estabeleceu com sucesso os modelos PDX subcutâneos de ATC e CEC de cabeça e pescoço. Há muitos aspectos a serem observados durante o processo de construção do modelo PDX. Quando o tecido tumoral é separado do paciente, ele deve ser colocado na caixa de gelo e enviado ao laboratório para inoculação o mais rápido possível. Depois que o tumor chega ao laboratório, o operador deve se atentar para manter um campo estéril e praticar procedimentos assépticos. Para amostras de biópsia por agulha, como…

Materials

2.4 mm x 2.0 mm trocar	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-9065
Balb/c nude mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	401
Biosafety cabinet	Suzhou Antai	BSC-1300IIA2
Blade	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0823
Centrifuge tube	Corning	430791/430829
Cryopreservation tube	Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd	/
Custodiol HTK-Solution	Custodiol	2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	SIGMA-ALORICH	D5879-500mL
Electronic balance	METTLER	ME104
Electronic digital caliper	Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd	0-220
fetal bovine serum(FBS)	VivaCell	C04001-500
IBM SPSS Statistics 26	IBM
Ketamine	Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd	100761663
Lenvatinib	ApexBio	A2174
NOD SCID immunodeficient mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	406
Pen-Strep Solution	Biological Industries	03-03101BCS
Petri dish	WHB	WHB-60/WHB-100
Saline	Sichuan Kelun	W220051705
Scissor	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0110
Tweezer	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-1241
Vet ointment	Pfizer Inc.	P10015353
Xylazine	Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd	070031777