Definizione e caratterizzazione di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di carcinoma anaplastico della tiroide e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo

Summary

Il presente protocollo stabilisce e caratterizza un modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) di carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC), poiché i modelli PDX stanno rapidamente diventando lo standard nel campo dell’oncologia traslazionale.

Abstract

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) preservano fedelmente le caratteristiche istologiche e genetiche del tumore primario e ne mantengono l’eterogeneità. I risultati farmacodinamici basati su modelli PDX sono altamente correlati con la pratica clinica. Il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) è il sottotipo più maligno di cancro della tiroide, con forte invasività, prognosi infausta e trattamento limitato. Sebbene il tasso di incidenza di ATC rappresenti solo il 2% -5% del cancro alla tiroide, il suo tasso di mortalità è pari al 15% -50%. Il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC) è uno dei tumori maligni della testa e del collo più comuni, con oltre 600.000 nuovi casi in tutto il mondo ogni anno. Qui vengono presentati protocolli dettagliati per stabilire modelli PDX di ATC e HNSCC. In questo lavoro, sono stati analizzati i fattori chiave che influenzano il tasso di successo della costruzione del modello e le caratteristiche istopatologiche sono state confrontate tra il modello PDX e il tumore primario. Inoltre, la rilevanza clinica del modello è stata convalidata valutando l’efficacia terapeutica in vivo di farmaci rappresentativi clinicamente utilizzati nei modelli PDX costruiti con successo.

Introduction

Il modello PDX è un modello animale in cui il tessuto tumorale umano viene trapiantato in topi immunodeficienti e cresce nell’ambiente fornito dai topi¹. I modelli tradizionali di linee cellulari tumorali soffrono di diversi svantaggi, come la mancanza di eterogeneità, l’incapacità di trattenere il microambiente tumorale, la vulnerabilità alle variazioni genetiche durante ripetuti passaggi in vitro e la scarsa applicazione clinica ^2,3. I principali inconvenienti dei modelli animali geneticamente modificati sono la potenziale perdita delle caratteristiche genomiche dei tumori umani, l’introduzione di nuove mutazioni sconosciute e la difficoltà di identificare il grado di omologia tra tumori murini e tumori umani⁴. Inoltre, la preparazione di modelli animali geneticamente modificati è costosa, dispendiosa in termini di tempo e relativamente inefficiente⁴.

Il modello PDX presenta molti vantaggi rispetto ad altri modelli tumorali in termini di rispecchiamento dell’eterogeneità tumorale. Dal punto di vista dell’istopatologia, sebbene la controparte murina sostituisca lo stroma umano nel tempo, il modello PDX conserva bene la struttura morfologica del tumore primario. Inoltre, il modello PDX conserva l’identità metabolomica del tumore primario per almeno quattro generazioni e riflette meglio le complesse interrelazioni tra le cellule tumorali e il loro microambiente, rendendolo unico nel simulare la crescita, le metastasi, l’angiogenesi e l’immunosoppressione del tessuto tumorale umano ^5,6,7. A livello cellulare e molecolare, il modello PDX riflette accuratamente l’eterogeneità inter- e intra-tumorale dei tumori umani, così come le caratteristiche fenotipiche e molecolari del cancro originale, inclusi i modelli di espressione genica, lo stato di mutazione, il numero di copie e la metilazione del DNA e la proteomica ^8,9. I modelli PDX con passaggi diversi hanno la stessa sensibilità alla terapia farmacologica, indicando che l’espressione genica dei modelli PDX è altamente stabile^10,11. Gli studi hanno dimostrato un’eccellente correlazione tra la risposta del modello PDX a un farmaco e le risposte cliniche dei pazienti a quel farmaco^12,13. Pertanto, il modello PDX è emerso come un potente modello di ricerca preclinica e traslazionale, in particolare per lo screening dei farmaci e la previsione della prognosi clinica.

Il cancro della tiroide è un tumore maligno comune del sistema endocrino ed è un tumore maligno umano che ha mostrato un rapido aumento dell’incidenza negli ultimi anni¹⁴. Il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) è il tumore tiroideo più maligno, con una sopravvivenza mediana del paziente di soli 4,8 mesi¹⁵. Sebbene solo una minoranza di pazienti affetti da cancro alla tiroide venga diagnosticata con ATC ogni anno in Cina, il tasso di mortalità è vicino al 100% ^16,17,18. L’ATC di solito cresce rapidamente e invade i tessuti adiacenti del collo e dei linfonodi cervicali, e circa la metà dei pazienti ha metastasi a distanza^19,20. Il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSCC) è il sesto tumore più comune al mondo e una delle principali cause di morte per cancro, con una stima di 600.000 persone affette da HNSCC ogni anno^21,22,23. HNSCC comprende un gran numero di tumori, compresi quelli nel naso, seni, bocca, tonsille, faringe e laringe²⁴. ATC e HNSCC sono due delle principali neoplasie della testa e del collo. Al fine di facilitare lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici e trattamenti personalizzati, è necessario sviluppare modelli animali preclinici robusti e avanzati come i modelli PDX di ATC e HNSCC.

Questo articolo introduce metodi dettagliati per stabilire il modello PDX sottocutaneo di ATC e HNSCC, analizza i fattori chiave che influenzano il tasso di prelievo del tumore nella costruzione del modello e confronta le caratteristiche istopatologiche tra il modello PDX e il tumore primario. Nel frattempo, in questo lavoro, sono stati eseguiti test farmacodinamici in vivo utilizzando i modelli PDX costruiti con successo al fine di convalidare la loro rilevanza clinica.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i protocolli dell’Associazione per la valutazione e l’accreditamento della cura degli animali da laboratorio approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’ospedale della Cina occidentale, Università del Sichuan. Per il presente studio sono stati utilizzati topi immunodeficienti NOD-SCID di età compresa tra 4-6 settimane (di entrambi i sessi) e topi nudi femmina Balb/c di età compresa tra 4-6 settim…

Representative Results

Sono stati trapiantati un totale di 18 campioni di cancro alla tiroide e sono stati costruiti con successo cinque modelli PDX di cancro alla tiroide (tasso di assunzione del tumore del 27,8%), inclusi quattro casi di tumori tiroidei indifferenziati e un caso di carcinoma anaplastico della tiroide. È stata analizzata la correlazione tra il tasso di successo della costruzione del modello e l’età, il sesso, il diametro del tumore, il grado del tumore e la differenziazione. Sebbene il tasso di successo del modello dei camp…

Discussion

Questo studio ha stabilito con successo i modelli PDX sottocutanei di ATC e HNSCC. Ci sono molti aspetti a cui prestare attenzione durante il processo di costruzione del modello PDX. Quando il tessuto tumorale viene separato dal paziente, deve essere messo nella ghiacciaia e inviato al laboratorio per l’inoculazione il prima possibile. Dopo che il tumore arriva in laboratorio, l’operatore deve prestare attenzione al mantenimento di un campo sterile e praticare procedure asettiche. Per i campioni di agobiopsia, poiché il…

Materials

2.4 mm x 2.0 mm trocar	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-9065
Balb/c nude mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	401
Biosafety cabinet	Suzhou Antai	BSC-1300IIA2
Blade	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0823
Centrifuge tube	Corning	430791/430829
Cryopreservation tube	Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd	/
Custodiol HTK-Solution	Custodiol	2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	SIGMA-ALORICH	D5879-500mL
Electronic balance	METTLER	ME104
Electronic digital caliper	Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd	0-220
fetal bovine serum(FBS)	VivaCell	C04001-500
IBM SPSS Statistics 26	IBM
Ketamine	Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd	100761663
Lenvatinib	ApexBio	A2174
NOD SCID immunodeficient mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	406
Pen-Strep Solution	Biological Industries	03-03101BCS
Petri dish	WHB	WHB-60/WHB-100
Saline	Sichuan Kelun	W220051705
Scissor	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0110
Tweezer	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-1241
Vet ointment	Pfizer Inc.	P10015353
Xylazine	Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd	070031777