Rapido sviluppo di circuiti di identificazione dello stato cellulare con poli-trasfezione

Summary

I circuiti genetici complessi richiedono molto tempo per progettare, testare e ottimizzare. Per facilitare questo processo, le cellule di mammifero vengono trasfettate in modo da consentire il test di più stechiometrie di componenti del circuito in un singolo pozzetto. Questo protocollo delinea le fasi per la pianificazione sperimentale, la trasfezione e l’analisi dei dati.

Abstract

I circuiti genetici dei mammiferi hanno dimostrato il potenziale per rilevare e trattare una vasta gamma di stati patologici, ma l’ottimizzazione dei livelli dei componenti del circuito rimane impegnativa e laboriosa. Per accelerare questo processo, il nostro laboratorio ha sviluppato la poli-trasfezione, un’estensione ad alto rendimento della trasfezione tradizionale dei mammiferi. Nella poli-trasfezione, ogni cellula della popolazione trasfettata esegue essenzialmente un esperimento diverso, testando il comportamento del circuito a diversi numeri di copie del DNA e consentendo agli utenti di analizzare un gran numero di stechiometrie in una reazione single-pot. Finora sono state dimostrate poli-trasfezioni che ottimizzano i rapporti di circuiti a tre componenti in un singolo pozzetto di cellule; In linea di principio, lo stesso metodo può essere utilizzato per lo sviluppo di circuiti ancora più grandi. I risultati della poli-trasfezione possono essere facilmente applicati per trovare rapporti ottimali tra DNA e co-transfettazione per circuiti transitori o per scegliere livelli di espressione per componenti circuitali per la generazione di linee cellulari stabili.

Qui, dimostriamo l’uso della poli-trasfezione per ottimizzare un circuito a tre componenti. Il protocollo inizia con i principi di progettazione sperimentale e spiega come la poli-trasfezione si basa sui tradizionali metodi di co-trasfezione. Successivamente, viene eseguita la poli-trasfezione delle cellule e seguita dalla citometria a flusso pochi giorni dopo. Infine, i dati vengono analizzati esaminando fette dei dati di citometria a flusso a singola cellula che corrispondono a sottoinsiemi di cellule con determinati rapporti componenti. In laboratorio, la poli-trasfezione è stata utilizzata per ottimizzare classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward, motivi bistabili e molti altri. Questo metodo semplice ma potente accelera i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero.

Introduction

Il campo della biologia sintetica dei mammiferi è progredito rapidamente, dallo sviluppo di semplici parti senso-e-risposta in linee cellulari in coltura all’ottimizzazione di reti complesse di geni per affrontare le sfide del mondo reale nella diagnostica e nella terapia¹. Questi sofisticati circuiti sono in grado di rilevare input biologici dai profili di microRNA alle citochine ai farmaci a piccole molecole e di implementare circuiti di elaborazione logica tra cui transistor, filtri passa-banda, interruttori a levetta e oscillatori. Hanno anche mostrato risultati promettenti in modelli animali di malattie come cancro, artrite, diabete e molti altri 1,2,3,4,5. Tuttavia, man mano che la complessità di un circuito cresce, l’ottimizzazione dei livelli di ciascuno dei suoi componenti diventa sempre più impegnativa.

Un tipo particolarmente utile di circuito genetico è un classificatore cellulare, che può essere programmato per rilevare e rispondere agli stati cellulari. La produzione selettiva di proteine o RNA in specifici stati cellulari è un potente strumento per guidare e programmare la differenziazione di cellule e organoidi, identificare e distruggere le cellule malate e/o i tipi di cellule indesiderabili e regolare la funzione delle cellule terapeutiche 1,2,3,4,5 . Tuttavia, la creazione di circuiti nelle cellule di mammifero in grado di classificare con precisione gli stati cellulari da più RNA cellulare e / o specie proteiche è stata molto impegnativa.

Uno dei passaggi più dispendiosi in termini di tempo per lo sviluppo di un circuito di classificazione cellulare è ottimizzare i livelli di espressione relativi dei singoli geni componenti, come sensori e fattori di elaborazione, all’interno del circuito. Per accelerare l’ottimizzazione dei circuiti e consentire la costruzione di circuiti più sofisticati, recenti lavori hanno utilizzato la modellazione matematica dei circuiti classificatori di celle e dei loro componenti per prevedere composizioni e topologie ottimali ^6,7. Mentre questo ha mostrato risultati potenti finora, l’analisi matematica è limitata dalla necessità di caratterizzare sistematicamente il comportamento input-output dei geni componenti nel circuito, che richiede tempo. Inoltre, una miriade di problemi dipendenti dal contesto possono emergere in circuiti genetici complessi, facendo sì che il comportamento di un circuito completo sfidi le previsioni basate sulle caratterizzazioni delle singole parti ^8,9.

Per sviluppare e testare più rapidamente circuiti complessi di mammiferi come i classificatori di stato cellulare, il nostro laboratorio ha sviluppato una tecnica chiamata poli-trasfezione¹⁰, un’evoluzione dei protocolli di co-trasfezione plasmidica. Nella co-trasfezione, più specie di DNA plasmidico sono complessate insieme con un reagente lipidico o polimerico caricato positivamente, quindi consegnate alle cellule in modo correlato (Figura 1A). Nella poli-trasfezione, i plasmidi sono complessati separatamente con il reagente, in modo tale che il DNA di ciascun complesso di trasfezione venga consegnato alle cellule in modo de-correlato (Figura 1B). Utilizzando questo metodo, le cellule all’interno della popolazione trasfettata sono esposte a numerose combinazioni di rapporti di due o più carichi utili di DNA che trasportano diversi componenti del circuito.

Per misurare i rapporti dei componenti del circuito consegnati a ciascuna cellula, ogni complesso di trasfezione all’interno di una poli-trasfezione contiene un reporter fluorescente costitutivamente espresso che funge da proxy per l’assorbimento cellulare del complesso. Il DNA di riempimento che non contiene alcun elemento attivo all’interno di una cellula di mammifero viene utilizzato per sintonizzare la quantità relativa del reporter fluorescente e dei componenti del circuito consegnati a una cellula in un singolo complesso di trasfezione e viene discusso più dettagliatamente nella discussione. Un esempio di DNA di riempimento utilizzato nel laboratorio Weiss è un plasmide contenente una sequenza di terminazione, ma nessun promotore, sequenza codificante, ecc. Le cellule con diversi rapporti di componenti del circuito possono quindi essere confrontate per trovare rapporti ottimali per la funzione del circuito genico. Questo a sua volta produce previsioni utili per la scelta di promotori e altri elementi del circuito per raggiungere livelli ottimali di espressione genica quando si combinano componenti del circuito in un singolo vettore per l’integrazione genetica (ad esempio, un lentivirus, un trasposone o una piattaforma di atterraggio). Pertanto, invece di scegliere i rapporti tra i componenti del circuito in base all’intuizione o tramite un processo di prova ed errore che richiede tempo, la poli-trasfezione valuta un’ampia gamma di stechiometrie tra le parti genetiche in una reazione a singolo piatto.

Nel nostro laboratorio, la poli-trasfezione ha permesso l’ottimizzazione di molti circuiti genetici, tra cui classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward e motivi bistabili. Questo metodo semplice ma potente accelera significativamente i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero. Da allora la poli-trasfezione è stata utilizzata per caratterizzare diversi circuiti genetici per rivelare le loro funzioni di trasferimento input-output multidimensionale ad alta risoluzione 10, ottimizzare una topologia circuitale alternativa per la classificazione dello stato cellulare¹¹ e accelerare vari progetti pubblicati^12,13 e in corso.

Qui descriviamo e rappresentiamo il flusso di lavoro per l’utilizzo della poli-trasfezione per ottimizzare rapidamente un circuito genetico (Figura 2). Il protocollo mostra come generare dati di poli-trasfezione di alta qualità ed evitare diversi errori comuni nel protocollo di poli-trasfezione e nell’analisi dei dati (Figura 3). Viene quindi illustrato come utilizzare la poli-trasfezione per caratterizzare semplici componenti del circuito e, nel processo, confrontare i risultati della poli-trasfezione con la co-trasfezione (Figura 4). Infine, i risultati della poli-trasfezione mostrano l’ottimizzazione del circuito del classificatore del cancro (Figura 5).

Protocol

NOTA: la Tabella 1 e la Tabella 2 fungono da riferimenti significativi per questo protocollo. La Tabella 1 mostra il ridimensionamento del reagente per le reazioni, e la Tabella 2 mostra l’aritmetica del rapporto DNA per un esempio di poli-trasfezione descritta nel protocollo (metà superiore) e per un possibile esperimento di follow-up (metà inferiore). 1. Preparare le cellule per la trasfezione As…

Representative Results

Nella Figura 1, confrontiamo la co-trasfezione con la poli-trasfezione. In una co-trasfezione, tutti i plasmidi vengono consegnati nello stesso mix di trasfezione, con conseguente alta correlazione tra la quantità di ciascun plasmide che ogni singola cellula riceve (Figura 1A). Mentre il numero di plasmidi totali consegnati a ciascuna cellula varia in modo significativo, la fluorescenza delle due proteine reporter nelle singole cellule in tutta la popolazione ?…

Discussion

I metodi di prototipazione rapida come la progettazione assistita da computer (CAD), il breadboard e la stampa 3D hanno rivoluzionato le discipline meccaniche, elettriche e di ingegneria civile. La capacità di cercare rapidamente tra molte possibili soluzioni a una determinata sfida accelera notevolmente i progressi in un campo. Riteniamo che la poli-trasfezione sia una tecnologia analoga per l’ingegneria biologica, che consente la prototipazione rapida dei circuiti genetici. Inoltre, altre tecnologie di prototipazione …

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI