Poly-transfection을 이용한 세포 상태 식별 회로의 신속한 개발
Summary
복잡한 유전 회로는 설계, 테스트 및 최적화에 시간이 많이 걸립니다. 이 과정을 촉진하기 위해 포유류 세포는 단일 웰에서 회로 구성 요소의 여러 화학량론을 테스트할 수 있는 방식으로 형질감염됩니다. 이 프로토콜은 실험 계획, transfection 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다.
Abstract
포유류의 유전 회로는 광범위한 질병 상태를 감지하고 치료할 수 있는 잠재력을 입증했지만 회로 구성 요소 수준의 최적화는 여전히 어렵고 노동 집약적입니다. 이 과정을 가속화하기 위해 우리 연구실은 전통적인 포유류 형질감염의 고처리량 확장인 폴리 형질감염을 개발했습니다. 폴리형질감염에서 형질주입된 집단의 각 세포는 본질적으로 서로 다른 실험을 수행하여 서로 다른 DNA 복제 수에서 회로의 거동을 테스트하고 사용자가 단일 포트 반응에서 많은 수의 화학량론을 분석할 수 있도록 합니다. 지금까지, 세포의 단일 웰에서 3성분 회로의 비율을 최적화하는 폴리-형질감염이 입증되었다; 원칙적으로 더 큰 회로를 개발하는 데 동일한 방법을 사용할 수 있습니다. 폴리형질주입 결과는 일시적인 회로를 위한 동시 형질감염에 대한 DNA의 최적 비율을 찾거나 안정적인 세포주 생성을 위한 회로 성분에 대한 발현 수준을 선택하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.
여기서는 3성분 회로를 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 실험 설계 원칙으로 시작하여 폴리 트랜스펙션이 전통적인 공동 트랜스펙션 방법을 기반으로 하는 방법을 설명합니다. 다음에, 세포의 폴리형질감염을 수행하고, 며칠 후에 유세포 분석을 수행한다. 마지막으로, 데이터는 특정 성분 비율을 가진 세포의 하위 집합에 해당하는 단일 세포 유세포 분석 데이터의 슬라이스를 검사하여 분석됩니다. 실험실에서 폴리-트랜스펙션은 세포 분류자, 피드백 및 피드포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프 등을 최적화하는 데 사용되었습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 단축합니다.
Introduction
포유류 합성 생물학 분야는 배양된 세포주에서 간단한 감지 및 반응 부분을 개발하는 것부터 진단 및 치료의 실제 문제를 해결하기 위한 복잡한 유전자 네트워크의 최적화에 이르기까지 빠르게 발전했습니다1. 이러한 정교한 회로는 microRNA 프로파일에서 사이토카인, 저분자 약물에 이르기까지 생물학적 입력을 감지하고 트랜지스터, 대역 통과 필터, 토글 스위치 및 발진기를 포함한 논리 처리 회로를 구현할 수 있습니다. 그들은 또한 암, 관절염, 당뇨병 등과 같은 질병의 동물 모델에서 유망한 결과를 보여주었습니다 1,2,3,4,5. 그러나 회로의 복잡성이 증가함에 따라 각 구성 요소의 레벨을 최적화하는 것이 점점 더 어려워지고 있습니다.
유전 회로의 특히 유용한 유형 중 하나는 세포 상태를 감지하고 반응하도록 프로그래밍할 수 있는 세포 분류기입니다. 특정 세포 상태에서 단백질 또는 RNA 산출물의 선택적 생산은 세포와 오가노이드의 분화를 유도 및 프로그래밍하고, 병든 세포 및/또는 바람직하지 않은 세포 유형을 식별 및 파괴하고, 치료 세포의 기능을 조절하는 강력한 도구입니다 1,2,3,4,5 . 그러나 여러 세포 RNA 및/또는 단백질 종에서 세포 상태를 정확하게 분류할 수 있는 포유류 세포에서 회로를 만드는 것은 매우 어려운 일이었습니다.
세포 분류 회로를 개발하는 데 가장 시간이 많이 소요되는 단계 중 하나는 회로 내에서 센서 및 처리 인자와 같은 개별 구성 요소 유전자의 상대적 발현 수준을 최적화하는 것입니다. 회로 최적화를 가속화하고 보다 정교한 회로의 구축을 허용하기 위해, 최근 연구에서는 최적의 조성 및 토폴로지를 예측하기 위해 셀 분류기 회로 및 그 구성 요소의 수학적 모델링을 사용했습니다(6,7). 이것은 지금까지 강력한 결과를 보여주었지만 수학적 분석은 회로에서 구성 요소 유전자의 입출력 거동을 체계적으로 특성화해야 하는 필요성으로 인해 시간이 많이 걸리기 때문에 제한적입니다. 또한, 복잡한 유전 회로에서 무수히 많은 문맥 의존적 문제가 나타날 수 있으며, 이로 인해 전체 회로의 동작이 개별 부분 특성화에 기초한 예측을 무시하게 됩니다(8,9).
세포 상태 분류기와 같은 복잡한 포유류 회로를 보다 신속하게 개발하고 테스트하기 위해 우리 연구실은 플라스미드 공동 형질주입 프로토콜의 진화인 폴리 형질감염10이라는 기술을 개발했습니다. 동시 형질감염에서 여러 플라스미드 DNA 종은 양전하를 띤 지질 또는 고분자 시약과 함께 복합체화된 다음 상관관계가 있는 방식으로 세포에 전달됩니다(그림 1A). 폴리형질감염에서, 플라스미드는 시약과 개별적으로 복합체화되어, 각각의 형질주입 복합체로부터의 DNA가 비상관된 방식으로 세포에 전달된다 (도 1B). 이 방법을 사용하여, 형질주입된 집단 내의 세포는 상이한 회로 성분을 운반하는 2개 이상의 DNA 페이로드 비율의 수많은 조합에 노출된다.
각각의 세포에 전달되는 회로 성분의 비율을 측정하기 위해, 폴리형질주입 내의 각각의 형질주입 복합체는 복합체의 세포 흡수에 대한 프록시로서 기능하는 구성적으로 발현된 형광 리포터를 함유한다. 포유동물 세포 내에서 활성인 어떠한 요소도 함유하지 않는 필러 DNA는 단일 형질감염 복합체에서 세포에 전달되는 형광 리포터 및 회로 성분의 상대적인 양을 조정하기 위해 사용되며, 논의에서 더 상세히 논의된다. Weiss 연구실에서 사용되는 필러 DNA의 예로는 터미네이터 서열을 포함하지만 프로모터, 코딩 서열 등을 포함하지 않는 플라스미드가 있습니다. 그런 다음 회로 구성 요소의 비율이 다른 세포를 비교하여 유전자 회로 기능에 대한 최적의 비율을 찾을 수 있습니다. 이는 차례로 유전자 통합을 위해 회로 구성 요소를 단일 벡터(예: 렌티바이러스, 트랜스포존 또는 랜딩 패드)로 결합할 때 최적의 유전자 발현 수준을 달성하기 위해 프로모터 및 기타 회로 요소를 선택하는 데 유용한 예측을 제공합니다. 따라서 직관에 따라 또는 시간이 많이 소요되는 시행착오 과정을 통해 회로 구성 요소 간의 비율을 선택하는 대신 poly-transfection은 단일 포트 반응에서 유전 부분 간의 광범위한 화학량론을 평가합니다.
우리 연구실에서 폴리 형질 감염은 세포 분류자, 피드백 및 피드 포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프를 포함한 많은 유전 회로의 최적화를 가능하게했습니다. 이 간단하지만 강력한 방법은 포유류 세포의 복잡한 유전 회로에 대한 설계 주기를 크게 단축합니다. 폴리-형질감염(Poly-transfection)은 이후 여러 유전 회로를 특성화하여 고분해능(high resolution)에서 다차원 입출력 전달 함수(input-output transfer function)를 밝히고(10), 세포 상태 분류(cell state classification)11를 위한 대체 회로 토폴로지(alternate circuit topology)를 최적화하며, 다양한 발표된12,13 및 진행 중인 프로젝트를 가속화하는 데 사용되었다.
여기서는 유전자 회로를 신속하게 최적화하기 위해 폴리 트랜스펙션을 사용하는 워크플로우를 설명하고 묘사합니다(그림 2). 이 프로토콜은 고품질 poly-transfection 데이터를 생성하고 poly-transfection 프로토콜 및 데이터 분석에서 몇 가지 일반적인 오류를 방지하는 방법을 보여줍니다(그림 3). 그런 다음 poly-transfection을 사용하여 간단한 회로 구성 요소를 특성화하고 그 과정에서 co-transfection에 대한 poly-transfection 결과를 벤치마킹하는 방법을 보여줍니다(그림 4). 마지막으로, 폴리형질감염의 결과는 암 분류자 회로의 최적화를 보여준다(도 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
CAD(Computer-Aided Design), 브레드보드 및 3D 프린팅과 같은 신속한 프로토타이핑 방법은 기계, 전기 및 토목 공학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 주어진 과제에 대한 가능한 많은 솔루션을 신속하게 검색할 수 있는 능력은 해당 분야의 발전을 크게 가속화합니다. 우리는 폴리 트랜스펙션이 생물 공학과 유사한 기술로, 유전자 회로의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 한다고 믿습니다. 또한 다른 래피드 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 폴리 형질 주입 방법 및 세포 분류제에 대한 적용을 주도하거나 기여한 전 Weiss Lab 구성원 인 Jeremy Gam, Bre DiAndreth 및 Jin Huh에게 감사드립니다. 추가 분석법 개발/최적화에 기여한 다른 Weiss 연구소 구성원: Wenlong Xu, Lei Wang 및 Christian Cuba-Samaniego; Josh Leonard 교수와 Patrick Donahue 및 Hailey Edelstein을 포함한 그룹 구성원은 poly-transfection을 테스트하고 피드백을 제공했습니다. 그리고 이 원고를 초대하고 피드백을 제공한 Nika Shakiba 교수. 또한 국립 보건원 [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792]에도 감사드립니다. 국립 과학 재단 [1745645]; 이 작업에 자금을 지원하기 위해 NCI 및 국립 보건원 [P30GM14051]의 암 센터 지원 (핵심) 보조금 [P50CCA14051, 부분적으로].
Materials
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
Riferimenti
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