ポリトランスフェクションによる細胞状態同定回路の急速開発
Summary
複雑な遺伝子回路は、設計、テスト、最適化に時間がかかります。このプロセスを容易にするために、哺乳類細胞は、単一のウェル内の回路コンポーネントの複数の化学量論の試験を可能にする方法でトランスフェクトされます。このプロトコルは、実験計画、トランスフェクション、およびデータ解析の手順を概説しています。
Abstract
哺乳類の遺伝子回路は、さまざまな病状を感知して治療する可能性を実証していますが、回路コンポーネントのレベルの最適化は依然として困難で労働集約的です。このプロセスを加速するために、私たちの研究室は、従来の哺乳類トランスフェクションのハイスループット拡張であるポリトランスフェクションを開発しました。ポリトランスフェクションでは、トランスフェクションされた集団の各細胞が本質的に異なる実験を行い、異なるDNAコピー数で回路の挙動をテストし、ユーザーがシングルポット反応で多数の化学量論を分析できるようにします。これまでに、細胞の単一ウェルにおける3成分回路の比率を最適化するポリトランスフェクションが実証されています。原則として、同じ方法をさらに大きな回路の開発に使用できます。ポリトランスフェクションの結果は、一過性回路のコトランスフェクションに対するDNAの最適な比率を見つけたり、安定した細胞株を生成するための回路コンポーネントの発現レベルを選択したりするために簡単に適用できます。
ここでは、ポリトランスフェクションを使用して3成分回路を最適化する方法を示します。このプロトコルは、実験デザインの原則から始まり、ポリトランスフェクションが従来のコトランスフェクション法に基づいてどのように構築されるかを説明しています。次に、細胞のポリトランスフェクションを行い、数日後にフローサイトメトリーを行います。最後に、特定の成分比を持つ細胞のサブセットに対応するシングルセルフローサイトメトリーデータのスライスを調べることによって、データを分析します。ラボでは、ポリトランスフェクションを使用して、細胞分類器、フィードバックおよびフィードフォワードコントローラー、双安定モチーフなどを最適化しています。このシンプルでありながら強力な方法は、哺乳類細胞の複雑な遺伝子回路の設計サイクルをスピードアップします。
Introduction
哺乳類合成生物学の分野は、培養細胞株における単純な感覚応答部分の開発から、診断および治療における現実世界の課題に対処するための遺伝子の複雑なネットワークの最適化まで、急速に進歩しています1。これらの高度な回路は、マイクロRNAプロファイルからサイトカイン、低分子薬物までの生物学的入力を検出し、トランジスタ、バンドパスフィルタ、トグルスイッチ、発振器などのロジック処理回路を実装することができます。彼らはまた、癌、関節炎、糖尿病、その他多くの疾患の動物モデルで有望な結果を示しています1,2,3,4,5。ただし、回路の複雑さが増すにつれて、各コンポーネントのレベルを最適化することはますます困難になります。
特に有用なタイプの遺伝子回路の1つは、細胞状態を感知して応答するようにプログラムすることができる細胞分類器である。特定の細胞状態でのタンパク質またはRNA出力の選択的産生は、細胞およびオルガノイドの分化をガイドおよびプログラムし、疾患細胞および/または望ましくない細胞型を特定および破壊し、治療細胞の機能を調節するための強力なツールです1,2,3,4,5 .しかし、複数の細胞RNAおよび/またはタンパク質種から細胞状態を正確に分類できる回路を哺乳類細胞で作成することは非常に困難でした。
細胞分類回路を開発する最も時間のかかるステップの1つは、回路内のセンサーやプロセシングファクターなどの個々の構成遺伝子の相対的な発現レベルを最適化することです。回路の最適化をスピードアップし、より洗練された回路の構築を可能にするために、最近の研究では、セル分類器回路とそのコンポーネントの数学的モデリングを使用して、最適な構成とトポロジーを予測しています6,7。これはこれまでのところ強力な結果を示していますが、数学的解析は、回路内の構成要素遺伝子の入出力挙動を体系的に特徴付ける必要があるため、時間がかかります。さらに、複雑な遺伝子回路では無数の文脈依存の問題が出現する可能性があり、フル回路の動作が個々の部分の特性評価に基づく予測に反する原因となります8,9。
細胞状態分類器などの複雑な哺乳類回路をより迅速に開発およびテストするために、私たちの研究室は、プラスミドコトランスフェクションプロトコルの進化形であるポリトランスフェクション10と呼ばれる技術を開発しました。コトランスフェクションでは、複数のプラスミドDNA種を正に帯電した脂質または高分子試薬と複合体化し、相関的に細胞に送達します(図1A)。ポリトランスフェクションでは、各トランスフェクション複合体からのDNAが非相関的に細胞に送達されるように、プラスミドを試薬と別々に複合体化します(図1B)。この方法を使用すると、トランスフェクトされた集団内の細胞は、異なる回路コンポーネントを運ぶ2つ以上のDNAペイロードの比率の多数の組み合わせにさらされます。
各細胞に送達される回路成分の比率を測定するために、ポリトランスフェクション内の各トランスフェクション複合体には、複合体の細胞取り込みの代理として機能する構成的に発現された蛍光レポーターが含まれています。哺乳類細胞内で活性な要素を含まないフィラーDNAは、単一のトランスフェクション複合体で細胞に送達される蛍光レポーターと回路成分の相対量を調整するために使用され、議論でより詳細に議論されます。Weissラボで使用されるフィラーDNAの例は、ターミネーター配列を含むプラスミドですが、プロモーター、コード配列などは含まれていません。次に、回路成分の比率が異なる細胞を比較して、遺伝子回路機能の最適な比率を見つけることができます。これにより、回路コンポーネントを遺伝子統合用の単一のベクター(レンチウイルス、トランスポゾン、ランディングパッドなど)に組み合わせるときに最適な遺伝子発現レベルを達成するために、プロモーターやその他の回路要素を選択するための有用な予測が得られます。したがって、ポリトランスフェクションは、直感に基づいて、または時間のかかる試行錯誤プロセス を介して 回路コンポーネント間の比率を選択する代わりに、シングルポット反応で遺伝子部分間の幅広い化学量論を評価します。
私たちの研究室では、ポリトランスフェクションにより、細胞分類器、フィードバックおよびフィードフォワードコントローラー、双安定モチーフなど、多くの遺伝子回路の最適化が可能になりました。このシンプルでありながら強力な方法は、哺乳類細胞の複雑な遺伝子回路の設計サイクルを大幅にスピードアップします。それ以来、ポリトランスフェクションは、いくつかの遺伝子回路の特性評価に使用され、高解像度で多次元入出力伝達関数を明らかにし10、細胞状態分類11の代替回路トポロジーを最適化し、さまざまな公開された12、13 および進行中のプロジェクトを加速しています。
ここでは、ポリトランスフェクションを使用して遺伝子回路を迅速に最適化するためのワークフローについて説明し、説明します(図2)。このプロトコルは、高品質のポリトランスフェクションデータを生成し、ポリトランスフェクションプロトコルおよびデータ解析におけるいくつかの一般的なエラーを回避する方法を示しています(図3)。次に、ポリトランスフェクションを使用して単純な回路コンポーネントの特性評価を行い、その過程でポリトランスフェクションの結果をコトランスフェクションに対してベンチマークする方法を示します(図4)。最後に、ポリトランスフェクションの結果は、がん分類回路の最適化を示しています(図5)。
Protocol
Representative Results
Discussion
コンピューター支援設計(CAD)、ブレッドボード、3D印刷などのラピッドプロトタイピング手法は、機械、電気、土木工学の分野に革命をもたらしました。特定の課題に対して考えられる多くのソリューションをすばやく検索する機能は、この分野の進歩を大幅に加速します。ポリトランスフェクションは生物工学の類似技術であり、遺伝子回路のラピッドプロトタイピングを可能にすると考え…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ポリトランスフェクション法の開発とその細胞分類器への応用を主導または貢献した元Weiss Labメンバー、Jeremy Gam、Bre DiAndreth、およびJin Huhに感謝します。さらなるメソッド開発/最適化に貢献した他のWeissラボメンバー:Wenlong Xu、Lei Wang、Christian Cuba-Samaniego。ジョシュ・レオナルド教授とパトリック・ドナヒューとヘイリー・エーデルスタインを含むグループメンバー、ポリトランスフェクションのテストとフィードバックの提供。ニカ・シャキバ教授がこの原稿を招待し、フィードバックを提供してくれました。また、国立衛生研究所[R01CA173712、R01CA207029、P50GM098792]にも感謝します。国立科学財団[1745645];NCIからのがんセンター支援(コア)助成金[P30CCA14051、一部]、および国立衛生研究所[P50GM098792]がこの作業に資金を提供してくれました。
Materials
| 15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
| 24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
| Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
| Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
| Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
| DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
| HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
| HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
| Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
| LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Trypsin | VWR | 25-053-CI |
Riferimenti
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