Complexe genetische circuits zijn tijdrovend om te ontwerpen, testen en optimaliseren. Om dit proces te vergemakkelijken, worden zoogdiercellen getransfecteerd op een manier die het testen van meerdere stoichiometrieën van circuitcomponenten in een enkele put mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft de stappen voor experimentele planning, transfectie en data-analyse.
Genetische circuits van zoogdieren hebben het potentieel aangetoond om een breed scala aan ziektetoestanden te detecteren en te behandelen, maar optimalisatie van de niveaus van circuitcomponenten blijft uitdagend en arbeidsintensief. Om dit proces te versnellen, ontwikkelde ons lab polytransfectie, een high-throughput uitbreiding van traditionele zoogdiertransfectie. Bij polytransfectie voert elke cel in de getransfecteerde populatie in wezen een ander experiment uit, waarbij het gedrag van het circuit op verschillende DNA-kopienummers wordt getest en gebruikers een groot aantal stoichiometrieën in een eenpotreactie kunnen analyseren. Tot nu toe zijn polytransfecties aangetoond die de verhoudingen van driecomponentencircuits in een enkele put van cellen optimaliseren; In principe kan dezelfde methode worden gebruikt voor de ontwikkeling van nog grotere circuits. Polytransfectieresultaten kunnen eenvoudig worden toegepast om optimale verhoudingen van DNA tot co-transfect te vinden voor transiënte circuits of om expressieniveaus te kiezen voor circuitcomponenten voor het genereren van stabiele cellijnen.
Hier demonstreren we het gebruik van polytransfectie om een driecomponentencircuit te optimaliseren. Het protocol begint met experimentele ontwerpprincipes en legt uit hoe polytransfectie voortbouwt op traditionele co-transfectiemethoden. Vervolgens wordt polytransfectie van cellen uitgevoerd en enkele dagen later gevolgd door flowcytometrie. Ten slotte worden de gegevens geanalyseerd door segmenten van de single-cell flowcytometriegegevens te onderzoeken die overeenkomen met subsets van cellen met bepaalde componentverhoudingen. In het lab is polytransfectie gebruikt om celclassificaties, feedback- en feedforwardcontrollers, bistabiele motieven en nog veel meer te optimaliseren. Deze eenvoudige maar krachtige methode versnelt ontwerpcycli voor complexe genetische circuits in zoogdiercellen.
Het gebied van de synthetische biologie van zoogdieren heeft zich snel ontwikkeld, van het ontwikkelen van eenvoudige zintuiglijke en responsonderdelen in gekweekte cellijnen tot de optimalisatie van complexe netwerken van genen om echte uitdagingen in diagnostiek en therapieën aan te pakken1. Deze geavanceerde circuits zijn in staat om biologische inputs te detecteren, van microRNA-profielen tot cytokines tot geneesmiddelen met kleine moleculen, en het implementeren van logische verwerkingscircuits, waaronder transistors, banddoorlaatfilters, tuimelschakelaars en oscillatoren. Ze hebben ook veelbelovende resultaten laten zien in diermodellen van ziekten zoals kanker, artritis, diabetes en nog veel meer 1,2,3,4,5. Naarmate de complexiteit van een circuit groeit, wordt het optimaliseren van de niveaus van elk van de componenten echter steeds uitdagender.
Een bijzonder nuttig type genetisch circuit is een celclassificatie, die kan worden geprogrammeerd om cellulaire toestanden te detecteren en erop te reageren. Selectieve productie van eiwit- of RNA-outputs in specifieke cellulaire toestanden is een krachtig hulpmiddel om differentiatie van cellen en organoïden te begeleiden en te programmeren, zieke cellen en / of ongewenste celtypen te identificeren en te vernietigen en de functie van therapeutische cellen te reguleren 1,2,3,4,5 . Het creëren van circuits in zoogdiercellen die celtoestanden van meerdere cellulaire RNA- en / of eiwitsoorten nauwkeurig kunnen classificeren, is echter zeer uitdagend geweest.
Een van de meest tijdrovende stappen van het ontwikkelen van een celclassificatiecircuit is het optimaliseren van de relatieve expressieniveaus van individuele componentgenen, zoals sensoren en verwerkingsfactoren, binnen het circuit. Om circuitoptimalisatie te versnellen en de bouw van meer geavanceerde circuits mogelijk te maken, heeft recent werk wiskundige modellering van celclassificatiecircuits en hun componenten gebruikt om optimale samenstellingen en topologieën te voorspellen 6,7. Hoewel dit tot nu toe krachtige resultaten heeft opgeleverd, wordt wiskundige analyse beperkt door de noodzaak om het input-outputgedrag van componentgenen in het circuit systematisch te karakteriseren, wat tijdrovend is. Verder kunnen een groot aantal contextafhankelijke problemen opduiken in complexe genetische circuits, waardoor het gedrag van een volledig circuit voorspellingen op basis van individuele onderdeelkarakteriseringentart 8,9.
Om sneller complexe zoogdiercircuits zoals celtoestandclassificatoren te ontwikkelen en te testen, ontwikkelde ons lab een techniek genaamd polytransfectie10, een evolutie van plasmide co-transfectieprotocollen. Bij co-transfectie worden meerdere plasmide-DNA-soorten samen met een positief geladen lipide- of polymeerreagens gecomplexeerd en vervolgens op een gecorreleerde manier aan cellen afgeleverd (figuur 1A). Bij polytransfectie worden plasmiden afzonderlijk gecomplexeerd met het reagens, zodat het DNA van elk transfectiecomplex op een gedecorreleerde manier aan cellen wordt afgeleverd (figuur 1B). Met behulp van deze methode worden cellen binnen de getransfecteerde populatie blootgesteld aan talrijke combinaties van verhoudingen van twee of meer DNA-ladingen die verschillende circuitcomponenten dragen.
Om de verhoudingen van circuitcomponenten te meten die aan elke cel worden geleverd, bevat elk transfectiecomplex binnen een polytransfectie een constitutief tot expressie gebrachte fluorescerende reporter die dient als een proxy voor cellulaire opname van het complex. Filler-DNA dat geen elementen bevat die actief zijn in een zoogdiercel, wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheid van de fluorescerende reporter en circuitcomponenten af te stemmen die aan een cel worden geleverd in een enkel transfectiecomplex en wordt in meer detail besproken in de discussie. Een voorbeeld van filler-DNA dat in het Weiss-lab wordt gebruikt, is een plasmide met een terminatorsequentie, maar geen promotor, coderende sequentie, enz. Cellen met verschillende verhoudingen van circuitcomponenten kunnen vervolgens worden vergeleken om optimale verhoudingen voor de gencircuitfunctie te vinden. Dit levert op zijn beurt nuttige voorspellingen op voor het kiezen van promotors en andere circuitelementen om optimale genexpressieniveaus te bereiken bij het combineren van circuitcomponenten in een enkele vector voor genetische integratie (bijvoorbeeld een lentivirus, transposon of landingsplatform). Dus in plaats van verhoudingen tussen circuitcomponenten te kiezen op basis van intuïtie of via een tijdrovend proces van vallen en opstaan, evalueert polytransfectie een breed scala aan stoichiometrieën tussen genetische delen in een eenpotreactie.
In ons lab heeft polytransfectie de optimalisatie van vele genetische circuits mogelijk gemaakt, waaronder celclassificaties, feedback- en feedforward-controllers en bistabiele motieven. Deze eenvoudige maar krachtige methode versnelt de ontwerpcycli voor complexe genetische circuits in zoogdiercellen aanzienlijk. Polytransfectie is sindsdien gebruikt om verschillende genetische circuits te karakteriseren om hun multidimensionale input-output overdrachtsfuncties met hoge resolutie10 te onthullen, een alternatieve circuittopologie voor celstatusclassificatie 11 te optimaliseren en verschillende gepubliceerde12,13 en lopende projecten te versnellen.
Hier beschrijven en verbeelden we de workflow voor het gebruik van polytransfectie om een genetisch circuit snel te optimaliseren (figuur 2). Het protocol laat zien hoe hoogwaardige polytransfectiegegevens kunnen worden gegenereerd en verschillende veelvoorkomende fouten in het polytransfectieprotocol en de gegevensanalyse kunnen worden vermeden (figuur 3). Vervolgens wordt gedemonstreerd hoe polytransfectie kan worden gebruikt om eenvoudige circuitcomponenten te karakteriseren en, in het proces, polytransfectieresultaten te benchmarken tegen co-transfectie (figuur 4). Ten slotte tonen de resultaten van polytransfectie optimalisatie van het kankerclassificatiecircuit (figuur 5).
Rapid prototyping-methoden zoals computerondersteund ontwerp (CAD), breadboarden en 3D-printen hebben een revolutie teweeggebracht in mechanische, elektrische en civieltechnische disciplines. Het vermogen om snel door vele mogelijke oplossingen voor een bepaalde uitdaging te zoeken, versnelt de vooruitgang in een veld aanzienlijk. Wij geloven dat polytransfectie een analoge technologie is voor biologische engineering, die snelle prototyping van genetische circuits mogelijk maakt. Bovendien vereisen andere rapid prototypi…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag voormalige Weiss Lab-leden bedanken die hebben geleid of bijgedragen aan de ontwikkeling van de polytransfectiemethode en de toepassing ervan op celclassificaties: Jeremy Gam, Bre DiAndreth en Jin Huh; andere Weiss-lableden die hebben bijgedragen aan verdere ontwikkeling / optimalisatie van methoden: Wenlong Xu, Lei Wang en Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard en groepsleden, waaronder Patrick Donahue en Hailey Edelstein, voor het testen van polytransfectie en het geven van feedback; en Prof. Nika Shakiba voor het uitnodigen van dit manuscript en het geven van feedback. We willen ook de National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] bedanken; Nationale Wetenschapsstichting [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, gedeeltelijk] van de NCI en National Institutes of Health [P50GM098792] voor de financiering van dit werk.
15mL Corning Falcon conical tubes | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | |
24-well petri dish | Any company of choice | (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free) | |
Bovine serum albumin | NEB | B9000S | |
Centrifuge | Any company of choice | Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf | |
Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX2000 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
Cytoflow | Non-commercial software package | https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# | |
DMEM | VWR | 10-013-CV | Use the correct media for your cell type |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 03690-100ML | |
Fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F4135 | |
HEK cells | ATCC | CRL-1573 | Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently. |
HeLa cells | ATCC | CRL-12401 | Use the relevant cell type for your experiments. |
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer | ThermoFisher Scientific | L3000001 | Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent |
LSRFortessa flow cytometer | BD Biosciences | N/A | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Any company of choice | ||
Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985070 | reduced serum medium |
Phosphate buffered saline | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
Rainbow calibration beads | Spherotech | URCP-100-2H | |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Trypsin | VWR | 25-053-CI |