Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مراقبة التغيرات في الخلايا البطانية الوريدية للوريد السري البشري عند الإصابة الفيروسية باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

تصف الدراسة الحالية بروتوكولا لمراقبة التغيرات في الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) أثناء العدوى الفيروسية باستخدام نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA).

Abstract

تبطن الخلايا البطانية السطح الداخلي لجميع الأوعية الدموية واللمفاوية، مما يخلق حاجزا شبه نافذ ينظم تبادل السوائل والمذاب بين الدم أو اللمف والأنسجة المحيطة بهما. تعد قدرة الفيروس على عبور الحاجز البطاني آلية مهمة تسهل انتشار الفيروس في جسم الإنسان. تم الإبلاغ عن العديد من الفيروسات لتغيير نفاذية البطانة و / أو التسبب في اضطراب حاجز الخلايا البطانية أثناء العدوى ، والتي يمكن أن تسبب تسرب الأوعية الدموية. تصف الدراسة الحالية بروتوكول تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA) ، باستخدام محلل خلايا تجاري في الوقت الفعلي لمراقبة سلامة البطانة وتغيرات النفاذية أثناء عدوى فيروس زيكا (ZIKV) للخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). تمت ترجمة إشارات المعاوقة المسجلة قبل وبعد الإصابة بفيروس زيكا إلى قيم مؤشر الخلية (CI) وتحليلها. يسمح بروتوكول RTCA بالكشف عن التأثيرات العابرة في شكل تغيرات مورفولوجية للخلايا أثناء العدوى الفيروسية. يمكن أن يكون هذا الفحص مفيدا أيضا لدراسة التغيرات في سلامة الأوعية الدموية ل HUVECs في الإعدادات التجريبية الأخرى.

Introduction

تبطن الخلايا البطانية (ECs) السطح الداخلي لجميع الأوعية الدموية واللمفاوية. وهي متصلة بواسطة تقاطعات فجوة ضيقة ، مما يخلق حاجزا شبه نافذ بين الدم أو الليمفاوية والأنسجة المحيطة 1,2. تعتبر تقاطعات الخلايا البطانية السليمة ضرورية لتنظيم نقل الجزيئات الكبيرة والمواد المذابة والسوائل ، وهي ضرورية للأنشطة الفسيولوجية للأنسجة والأعضاء المقابلة3. الحاجز البطاني ديناميكي ومعدل بواسطة محفزات محددة4. يعد اضطراب أو فقدان وظيفة الحاجز البطاني سمة مميزة للفيزيولوجيا المرضية للمرض في الالتهاب الحاد والمزمن في التسبب في العديد من الأمراض5،6،7 ، بما في ذلك العدوى الفيروسية8،9،10،11. بالنسبة للفيروسات المصفرة ، وجد أن البروتين غير الهيكلي NS1 يمكن أن يغير نفاذية البطانة ، على سبيل المثال ، عن طريق تعطيل الطبقة الشبيهة بالجليكوكاليكس البطانية نتيجة لزيادة التعبير وتنشيط cathepsin L ، sialidases ، و endoglycosidaseheparinase 9. في حالة المرض ، تتأثر سلامة الطبقة الأحادية البطانية ، وتتعطل تقاطعات الخلايا الخلوية ، مما قد يؤدي إلى إصابة البطانة واختلال وظيفي12 وفي النهاية مظاهر مرضية واسعة الانتشار عبر أنظمة أعضاء متعددة13,14. تؤدي العدوى الفيروسية ل ECs إلى تغييرات في مسارات إشارات الخلية وملف التعبير الجيني الخلوي ، مما قد يؤثر على وظائف حاجز السوائل ، ويسبب اضطرابا في ECs ، ويحفز تسرب الأوعية الدموية10,15. تم العثور على عدوى فيروس زيكا (ZIKV) من ECs لتعطيل سلامة الموصل الذي يسبب تغيرات في نفاذية الأوعية الدموية ويؤدي إلى خلل في الحاجز البطاني ، مما يؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية10,15. وقد أظهرت الدراسات أن فيروس زيكا مرتبط بالعيوب الخلقية الشديدة. ومع ذلك ، لا يعرف الكثير عن الآلية الدقيقة التي يحدث بهاهذا 16,17. لذلك فإن فهم تغيرات الحاجز البطاني أثناء العدوى أمر بالغ الأهمية لفهم آلية المرض.

تستخدم ECs حاليا كنظام تجريبي مهم في نموذج الأوعية الدموية في المختبر لمختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية18،19،20،21. تم استخدام الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) على نطاق واسع كنظام خلوي أولي غير خالد لدراسة البطانة الوعائية وبيولوجيا الأوعية الدموية في المختبر22،23،24،25. تم عزل HUVECs لأول مرة للثقافة في المختبر في أوائل سبعينيات القرن العشرين من الوريد السري للحبل السري البشري26. تحتوي HUVECs على مورفولوجيا تشبه الحصى يمكن بسهولة تكاثرها في المختبر. بسبب إجهاد القص بعد الحفاظ عليه لفترات طويلة في حالة الالتقاء ، لوحظ استطالة شكل الخلية. يمكن أن تتميز HUVECs بوجود أجسام Weibel و Palade (WPB) ، والحويصلات pinocytic ، وكميات صغيرة من الألياف الموجودة بالقرب من النواة ، والميتوكوندريا ذات الأشكال الأنبوبية التي نادرا ما تظهر تشعباتها ، ونواة إهليلجية ذات نمط حبيبي دقيق من الكروماتين المكثف ، ونواة واحدة إلى ثلاث نوى موجودة في كل نواة27. على الرغم من أن HUVECs تظهر العديد من الخصائص المورفولوجية ، إلا أنه لا يمكن تحديد HUVECs عن طريق الفحص البصري وحده. تستخدم المقايسات ، مثل تلطيخ التألق المناعي للبطانة الوعائية (VE) -cadherin ، بشكل شائع لمراقبة سلامة الأوعية الدموية في HUVECs28،29،30،31.

تصف هذه الدراسة بروتوكول تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA) لعدوى HUVECs. يستخدم نظام RTCA ألواحا متخصصة مطلية بالذهب تحتوي على أقطاب كهربائية دقيقة توفر سطحا موصلا لربط الخلية. عندما تلتصق الخلايا بسطح القطب الدقيق ، يتم تشكيل حاجز يعيق تدفق الإلكترون عبر الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يمكن استخدام قياس المعاوقة الناتجة عن الأقطاب الكهربائية الدقيقة للحصول على معلومات حول بعض العمليات الخلوية ، بما في ذلك ارتباطات الخلايا والانتشار والهجرة32. الفحص المبلغ عنه هو فحص خلوي قائم على المعاوقة ، إلى جانب محلل الخلايا في الوقت الفعلي ، يوفر قياسا مستمرا لتكاثر الخلايا الحية ، وتغيرات التشكل (مثل تقلص الخلايا) وجودة ارتباط الخلية بطريقة غير جراحية وخالية من الملصقات. في هذه الدراسة ، يتم استخدام محلل الخلايا في الوقت الفعلي لمراقبة سلامة البطانة والتغيرات المورفولوجية ل HUVECs أثناء عدوى ZIKV. باختصار ، يقيس الجهاز تدفق الإلكترون المنقول في ألواح المعايرة الدقيقة المطلية بالذهب الدقيقة في وجود وسط ثقافة (محلول موصل كهربائيا). يؤدي التصاق الخلية أو التغيرات في عدد الخلايا والتشكل إلى إزعاج تدفق الإلكترون ويسبب اختلافات في المعاوقة يمكن التقاطها بواسطة الأداة (الشكل التكميلي 1). يتم تسجيل الفرق بين نمو HUVEC وانتشاره والالتزام قبل وبعد الإصابة بفيروس ZIKV في الوقت الفعلي بواسطة إشارة مقاومة كهربائية ثم ترجمته إلى قيمة مؤشر الخلية (CI). يتم استخدام قيمة CI من مرحلة ما قبل العدوى كخط أساس لتطبيع قيمة CI. تعكس التغييرات في قيم CI التغيرات المورفولوجية الخلوية أو فقدان التصاق الخلية عند الإصابة33. تظهر نتائج الدراسة أن بروتوكول RTCA يسمح بالكشف عن التأثيرات العابرة أو التغيرات المورفولوجية للخلايا أثناء العدوى الفيروسية مقارنة بمقايسة نقطة النهاية ، مثل تلطيخ التألق المناعي ل VE-cadherin. يمكن أن تكون طريقة RTCA مفيدة لتحليل تغيرات سلامة الأوعية الدموية HUVEC عند الإصابة بفيروسات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الخلية

  1. إعداد HUVECs
    1. تنمو 7.5 × 105 خلايا HUVEC / مل في 75 سم2 (مغلفة ب 20 ميكروغرام / مل كولاجين من النوع 1) دورق زراعة الخلايا يحتوي على 12 مل من وسط الخلايا البطانية (ECM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، 0.01٪ مكمل نمو الخلايا البطانية (ECGS) الذي يحتوي على عوامل النمو والهرمونات والبروتينات اللازمة لثقافة HUVECs ، و 0.01٪ بنسلين-ستربتومايسين (P / S). احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 (الشكل 1).

2. إعداد تجربة RTCA

  1. تشغيل التحقق من المقاوم على RTCA
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج RTCA في سطح المكتب لتشغيل التطبيق. ستظهر نافذة تسجيل الدخول ، اكتب اسم المستخدم وكلمة المرور لتسجيل الدخول.
    2. ضع لوحة مقاومة RTCA ذات 96 بئرا بحيث يكون البئر A1 مواجها للداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا.
    3. في علامة التبويب Exp Notes في برنامج RTCA، اكتب اسم التجربة وSN للجهاز ونوع الجهاز (لوحة مراقبة الجودة).
    4. في علامة التبويب تخطيط ضمن علامة التبويب خلية في برنامج RTCA ، قم بتمييز جميع الآبار وانقر بزر الماوس الأيمن على الآبار المميزة للتأكد من تشغيل جميع الآبار (باللون الرمادي).
    5. في علامة التبويب جدولة في برنامج RTCA، انقر فوق Step_1. أدخل عمليات المسح: 10 ، والفاصل الزمني: 30 ثانية. انقر على تطبيق. انقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج لبدء تشغيل التحقق.
      ملاحظة: تأكد من أن توصيل الآبار بمحطة RTCA على ما يرام من خلال ملاحظة "مسح اللوحة. اتصالات موافق" في أسفل الصفحة.
  2. تشغيل التحقق من المقاوم لتحليل البيانات
    1. في علامة التبويب فهرس الخلية ، تحقق من البيانات عند الانتهاء من التشغيل. يجب أن تكون جميع قيم CI أقل من 0.063.
    2. في الجزء السفلي من علامة التبويب فهرس الخلية ، تحقق من بيانات الفحص الأولية. يجب أن تظهر بيانات المسح الأولي أنماط قيم متكررة تبلغ 40.0 ± 2.0 (الصفان A و H) و 67.5 ± 2.5 (الصفان B و G) و 93.6 ± و 2.9 (الصفان C و F) و 117.6 ± 3.2 (الصفان D و E).
    3. لإيقاف تشغيل التحقق، انقر فوق لوحة > لوحة تحرير. لوحة مقاومة RTCA ذات 96 بئرا جاهزة الآن للإزالة من محطة RTCA.
  3. الحصول على قراءة خلفية على RTCA
    1. اغسل صفيحة الإلكترود الدقيقة المتخصصة المطلية بالكولاجين من النوع 1 (المغلفة ب 20 ميكروغرام / مل من الكولاجين من النوع 1) مع 60 ميكرولتر / بئر من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS ؛ مع بيكربونات الصوديوم ، بدون كلوريد الكالسيوم وكبريتات المغنيسيوم) 2x.
    2. تخلص من HBSS المتبقي وأضف 50 ميكرولتر / بئر من ECM. ضع لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة التي تحتوي على ECM مع توجيه البئر A1 إلى الداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا.
    3. في علامة التبويب Exp Notes في برنامج RTCA، اكتب اسم التجربة وSN للجهاز ونوع الجهاز (تنسيق 96-well).
    4. في علامة التبويب تخطيط ضمن علامة التبويب خلية في برنامج RTCA ، قم بتمييز الآبار التي سيتم استخدامها وانقر بزر الماوس الأيمن على الآبار المميزة للتأكد من تشغيل جميع الآبار (باللون الرمادي).
    5. في علامة التبويب جدولة في برنامج RTCA ، انقر فوق Step_1 ، وانقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج للحصول على قراءة الخلفية.
      ملاحظة: تأكد من صحة توصيل الآبار من خلال ملاحظة "مسح اللوحة. اتصالات موافق" في أسفل الصفحة.
    6. بمجرد الحصول على قراءة الخلفية ، تكون لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة جاهزة الآن لبذر الخلايا وجاهزة للإزالة من محطة RTCA.
  4. تحضير HUVEC في لوحة الذهب الدقيقة المتخصصة
    1. قم بزرع HUVECs في لوحة القطب الدقيق الذهبي المتخصصة مع 50 ميكرولتر / بئر من الوسط المكيف ، 1 × 104 خلايا / بئر (وسط مكيف: ECM مكمل ب 10٪ FBS ، 0.01٪ ECGS ، و 0.01٪ P / S). ضع اللوحة مرة أخرى في محطة RTCA مع توجيه البئر A1 للداخل للحضانة الليلية في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: تم إجراء عدد الخلايا على تعليق الخلية مع عامل تخفيف اثنين باستخدام مقياس الدم.
    2. في علامة التبويب جدولة ، انقر على إضافة خطوة في الزاوية العلوية اليمنى. انقر فوق Step_2 وقم بتغيير عمليات المسح: 601 ، والفاصل الزمني: 2 دقيقة. انقر فوق تطبيق. انقر فوق Step_2 وانقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج.
    3. بعد 20 ساعة من الحضانة وعندما تظهر قيم CI في علامة تبويب الرسم البياني للبئر هضبة ، تكون اللوحة جاهزة للعدوى. في علامة التبويب جدولة من برنامج RTCA، انقر فوق إحباط الخطوة.
    4. لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة جاهزة الآن للإزالة من محطة RTCA للخطوات اللاحقة.

3. العدوى الفيروسية في HUVECs

  1. تخفيف الفيروس
    1. يتم الاحتفاظ بمخزون ZIKV عند -80 درجة مئوية. في هذه الدراسة ، قم بإزالة مخزون الفيروس المحفوظ في القوارير المبردة وتخفيف مخزون ZIKV باستخدام ECM الخالي من المصل في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل لتحقيق تعدد العدوى (MOIs) بمقدار 0.1 و 1.
      ملاحظة: تم تحضير مخزون ZIKV مسبقا عن طريق إجراء التكاثر في خلايا Vero وحصاد طاف ZIKV34.
  2. إصابة الخلية أحادية الطبقة
    1. قم بإزالة وتجاهل الوسط المكيف (ECM المكمل ب 10٪ FBS و 0.01٪ ECGS و 0.01٪ P / S) من كل بئر. شطف كل بئر مع 60 ميكرولتر من HBSS 2x. أدخل HBSS بمساعدة جانب البئر ؛ لا تطلق النار على الخلية أحادية الطبقة.
    2. من أعلى إلى أدنى تخفيف ، أضف 40 ميكرولتر من كل عينة فيروس مخففة في ECM خالية من المصل في البئر. قم بمضاعفة البئر ثلاث مرات لكل تخفيف والحفاظ على ستة آبار بدون عدوى (التحكم السلبي والثرومبين المتحكم الإيجابي). لا تطلق النار على الخلية أحادية الطبقة ؛ بدلا من ذلك ، أضف الفيروس المخفف بمساعدة جانب البئر. استخدم طرف ماصة جديد لكل إدخال.
      ملاحظة: تم اختيار الثرومبين كعنصر تحكم إيجابي لأنه يمكن أن يزيد من نفاذية البطانة ل HUVECs بسرعة.
    3. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للسماح بامتصاص الفيروس. حفيف اللوحة 5 مرات كل 15 دقيقة للسماح بامتصاص الفيروس في جميع أنحاء الطبقة الأحادية للخلية.
  3. إضافة وسط زراعة الخلايا المتراكبة
    1. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة معلق الفيروس وتجاهله من أدنى تركيز إلى أعلى.
    2. اغسل الخلايا المصابة ب 60 ميكرولتر من HBSS 2x. تراكب البئر مع ECM تستكمل مع 2 ٪ FBS. بالنسبة لآبار التحكم الإيجابية ، قم بتخفيف الثرومبين إلى 20 وحدة / مل مع ECM المكمل ب 2٪ FBS ، وقم بتراكب الآبار بوسط ECM المحتوي على الثرومبين. لا تطلق النار على الخلية أحادية الطبقة ؛ بدلا من ذلك ، أضف وسائط تراكب بمساعدة جانب البئر.
  4. إعادة صفيحة الأقطاب الكهربائية الدقيقة المتخصصة المصابة إلى محطة RTCA
    1. في علامة التبويب جدولة ، انقر على إضافة خطوة في الزاوية العلوية اليمنى. انقر فوق Step_3 وقم بتغيير عمليات المسح: 3,601 والفاصل الزمني: 2 دقيقة. انقر فوق تطبيق.
    2. انقر فوق موافق في النافذة المنبثقة التي تظهر. ضع لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة المصابة بحيث يكون البئر A1 متجها إلى الداخل في محطة RTCA الموجودة في حاضنة زراعة الخلايا.
    3. انقر فوق Step_3 وانقر فوق ابدأ / متابعة في الزاوية العلوية اليسرى من البرنامج.

4. تحليل البيانات وتصدير البيانات

  1. إضافة معلومات تجريبية لكل بئر
    1. في علامة التبويب تخطيط ، انقر فوق علامة التبويب خلية (الشكل 2 أ). لإدخال معلومات الخلية المستهدفة وتحديد نوع البئر لكل بئر ، قم بتمييز البئر واكتب اسم الخلية المستهدفة ورقمها ولونها في الجزء السفلي من البرنامج. انقر فوق تطبيق (الشكل 2 ب).
    2. لتحديد نوع البئر وتحديده لكل بئر في علامة التبويب خلية ، قم بتمييز البئر، وحدد نوع البئر (عينة أو عنصر تحكم موجب أو عنصر تحكم سالب)، وانقر فوق تعيين.
    3. في علامة التبويب تخطيط ، انقر فوق علامة التبويب العلاج (الشكل 2C). لإدخال معلومات العلاج ، قم بتمييز البئر واكتب اسم العلاج وتركيز المعالجة والوحدة واللون. انقر فوق تطبيق (الشكل 2D).
    4. لتحديد نوع البئر وتحديده لكل بئر في علامة التبويب المعالجة ، قم بتمييز البئر، وحدد نوع البئر (عينة، أو عنصر تحكم إيجابي، أو تحكم سلبي)، وانقر فوق تعيين.
      ملاحظة: لكل اختيار ، يمكن تمييز آبار متعددة في نفس الوقت.
  2. تطبيع قيمة CI
    1. انقر بزر الماوس الأيمن على يمين علامة التبويب تحليل البيانات وحدد فهرس الخلية الطبيعي من المربع المنسدل المحور ص (الشكل 3 أ). في قسم المحور X في الأسفل ، حدد الوقت الطبيعي كآخر نقطة زمنية تم قياسها حيث تمت إزالة لوحة القطب الذهبي الدقيقة المتخصصة للعدوى (الشكل 3B).
      ملاحظة: تزيل عملية التطبيع التي يقوم بها البرنامج معظم التباين بسبب الاختلافات في بذر البئر والتعلق ، طالما أن نقطة التطبيع المختارة هي قبل إضافة الفيروس و / أو العلاج. ومن ثم ، يجب أن تكون النقطة الزمنية المثلى للتطبيع هي النقطة الزمنية الأخيرة قبل إضافة الفيروس و / أو العلاج. يمكن التحقق من النقطة الزمنية للتطبيع في علامة التبويب "جدول" ضمن Step_2. إجمالي الوقت المشار إليه هو النقطة الزمنية للتطبيع (الشكل 3C).
  3. تخطيط البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج RTCA
    1. في علامة التبويب تحليل البيانات ، حدد الآبار المراد إضافتها إلى الرسم البياني عن طريق تمييز الآبار والنقر فوق << إضافة. مؤشر الخلية الذي تمت تسويته مقابل الرسم البياني الزمني جاهز الآن للنسخ والتصدير. تأكد من وضع علامة في مربع الاختيار متوسط .
  4. تصدير البيانات باستخدام برنامج RTCA
    1. في الزاوية العلوية اليمنى من برنامج RTCA، انقر على اللوحة > تصدير معلومات التجربة.... حدد المربع لتحديد البيانات المراد تصديرها. انقر فوق موافق.
      ملاحظة: يمكن تصدير البيانات الأولية (قيم CI الأولية) عند تحديد فهرس الخلية > الكل .
    2. حدد المجلد لحفظ ملف التصدير. انقر على حفظ. ستظهر نافذة منبثقة تشير إلى تصدير المعلومات التجريبية. بمجرد الانتهاء من التصدير ، ستظهر نافذة أخرى تشير إلى أن معلومات التجربة المصدرة جاهزة للعرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل الإصابة بفيروس زيكا ، كان CI المسجل لطبقة HUVEC أحادية الطبقة المستزرعة على صفيحة عيار دقيق مطلية بالذهب الدقيق أعلى من 8 ، مما يشير إلى خصائص الالتصاق القوية. يجب التخلص من الألواح أو الآبار ذات مؤشر CI أقل من 8. ثم أصيبت HUVECs بفيروس ZIKV عند MOI من 0.1 و 1 ، وتم تسجيل مقاومة الخلية لمدة 7 أيام. بدأت قيمة CI لمركبات HUVEC المصابة بفيروس ZIKV P6-740 عند MOI من 0.1 (الخط الأزرق الفاتح) في الانخفاض عند 15 ساعة بعد الإصابة (HPI) ، مقارنة بمكافحة العدوى السلبية (الخط البني; الشكل 4). أما بالنسبة لمركبات HUVEC المصابة بجرعة أعلى من ZIKV P6-740 عند MOI من 1 (الخط الأزرق) ، فقد بدأت قيمة CI في الانخفاض في وقت مبكر عند 11 HPI. عند 24 HPI ، كان هناك انخفاض بنسبة 5٪ و 7٪ في قيمة CI الطبيعية (0.949 ، 0.929) عندما أصيبت ECs بفيروس ZIKV عند MOI من 0.1 و 1 ، على التوالي. تم تسجيل انخفاض بنسبة 50٪ في قيمة CI الطبيعية عند 96 HPI وعند 66.75 HPI عند الإصابة بفيروس ZIKV عند MOI من 0.1 و 1 ، على التوالي. وصلت قيمة CI الطبيعية إلى أدنى نقطة لها عند 107 HPI ، حيث كان هناك انخفاض بنسبة 51٪ و 60٪ (0.4915 ، 0.3984) عند الإصابة بفيروس ZIKV عند MOI بنسبة 0.1 و 1 على التوالي. تم العثور على قيمة CI الطبيعية لزيادة 4٪ و 13٪ من 107 HPI فصاعدا حتى نهاية التجربة عند 168 HPI (0.5128 ، 0.4571). يظهر الخط الأسود تأثيرات الثرومبين المستخدم كعنصر تحكم إيجابي ، حيث ظلت قيم CI منخفضة طوال التجربة ، محاكية اضطراب الوصلات الضيقة ، وتسرب الأوعية الدمويةالمستحث 35.

Figure 1
الشكل 1: الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). الرقم في تكبير 40x لعرض معدل التقارب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: لقطات شاشة لعلامة التبويب الخلية والعلاج ضمن علامة التبويب تخطيط في برنامج RTCA. (أ) في علامة التبويب تخطيط ، انقر فوق علامة التبويب الخلية . (ب) لإدخال معلومات الخلية المستهدفة وتحديد نوع البئر لكل بئر ، قم بتمييز البئر واكتب اسم الخلية المستهدفة ورقمها ولونها في الجزء السفلي من البرنامج. انقر على تطبيق. (ج) انقر فوق علامة التبويب تخطيط ضمن علامة التبويب المعالجة . (د) لإدخال معلومات المعالجة، ظلل البئر واكتب اسم المعالجة وتركيز المعالجة والوحدة واللون. انقر على تطبيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: لقطات شاشة لعلامة التبويب تحليل البيانات في برنامج RTCA لتطبيع فهرس الخلية. (أ) في المربع المنسدل المحور ص ، حدد فهرس الخلية المعياري. (B) في قسم المحور X ، حدد وقت التطبيع. (ج) لقطة شاشة لعلامة التبويب "جدول" في برنامج RTCA. يشار إلى وقت التطبيع في الوقت الإجمالي Step_2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مؤشر الخلية الطبيعي مقابل المخطط الزمني للعدوى بفيروس زيكا (ZIKV) في الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). تم طلاء لوحة الإلكترود الذهبي الدقيقة المتخصصة ب 20 ميكروغرام / مل من الكولاجين من النوع 1. تم زرع HUVECs بكثافة 1.0 × 104 خلايا / بئر. تم استخدام ZIKV P6-740 (MOI: 0.1 ، 1) للعدوى. أزرق فاتح: ZIKV P6-740 (وزارة الداخلية: 0.1) ؛ الأزرق: ZIKV P6-740 (وزارة الداخلية: 1) ؛ أسود: الثرومبين كعنصر تحكم إيجابي (20 وحدة / مل) ؛ براون: السيطرة السلبية على العدوى. تشير كل نقطة بيانات إلى المتوسط وتم تحليلها في ثلاث نسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: رسم تخطيطي على التقنية المستخدمة في RTCA القائم على مقاومة المستشعر الحيوي الكهربائي. منظر جانبي للوحة البئر ؛ يوجد في قاع الآبار محطات سلبية وإيجابية مطلية بالذهب. نظرا لأن الجهاز يقيس CI في البئر الصغير الذي يحتوي على وسائط استزراع تسمح بتوصيل الكهرباء ، يتدفق الإلكترون من الطرف السالب إلى الطرف الموجب. عندما يكون عنصر تحكم فارغا ، يكون تدفق الإلكترون سلسا ، وبالتالي لا يتم تسجيل أي مقاومة. عندما يتم زرع الخلايا ، ومع تعلق المزيد والمزيد من الخلايا بقاع البئر ، تكون المقاومة في تدفق الإلكترون موجودة ومسجلة بواسطة الكمبيوتر. باستخدام قيمة المعاوقة هذه ، تقوم الأداة بتحويلها إلى قيمة CI ، مما يشير إلى عدد الخلايا المرتبطة بقاع البئر (الالتصاق). تم إنشاؤها باستخدام BioRender. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عادة ما ترتبط العدوى الفيروسية الخلوية في الخلايا المتساهلة بتغيرات كبيرة في مورفولوجيا الخلايا والتخليق الحيوي36. تعرف التغيرات المورفولوجية الخلوية التي يسببها الفيروس ، مثل تقلص الخلايا و / أو تضخم الخلايا و / أو تكوين الخلايا الاصطناعية ، أيضا باسم تأثيرات الاعتلال الخلوي (CPEs) ، المميزة لبعض أنواع العدوى الفيروسية37. في ECs ، تم وصف CPE بأنه تدمير الخلايا وانهيار التقاطعات الضيقة بين كل EC ، مما تسبب في انهيار الحاجز البطاني38,39. يمكن وصف CPEs في HUVECs بأنها انفصال خلية أحادية الطبقة وتطفو من وعاء زراعة الأنسجة. يمكن اكتشاف التغيرات المورفولوجية للخلايا المصابة ، مثل انفصال الخلايا الملتصقة وتعويمها ، بشكل مستمر باستخدام طريقة RTCA. تعتمد هذه التقنية على المعاوقة الكهربائية ، والتي تسمح بمراقبة الخلايا في الوقت الفعلي حتى كل بضع ثوان. يسمح بالقياس الكمي لتكاثر الخلايا ، والتغيرات المورفولوجية ، وفي حالة HUVECs ، يمكن استخدامه لمراقبة التغيرات في سلامة البطانة ووظيفة حاجز الخلية40 عند التحفيز.

في هذه الدراسة ، الخطوة الحاسمة هي إعداد التجربة ، حيث يتم استخدام لوحة المقاومة ذات 96 بئرا. هذا للتأكد من أن جميع وصلات المحلل متصلة جيدا باللوحة. في RTCA ، يتم تحويل قيمة المعاوقة المقاسة كقيمة CI للتمييز بين الاختلافات في عدد الخلية ودرجة الالتصاق والتشكل الخلوي وصلاحية الخلية41. يشير الانخفاض في المعاوقة المسجلة بواسطة محلل RTCA ، والذي يترجم إلى انخفاض في قيمة CI ، إلى انخفاض عدد الخلايا ، ودرجة الالتصاق الأضعف ، وتغييرات كبيرة في التشكل الخلوي42. لذلك ، من المهم أيضا اختبار مدى ملاءمة خطوط الخلايا وأرقام الخلايا المثلى لاستخدامها في تجربة RTCA. من الأهمية بمكان تحديد ما إذا كان يمكن تحقيق مؤشر CI المطلوب قبل تنفيذ الاختبار على الخلايا باستخدام نظام RTCA. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد هذا أيضا في تحديد ما إذا كان نظام RTCA مناسبا لمراقبة نمو الخلايا وملفات تعريف موت الخلايا لأنواع الخلايا المحددة. في دراستنا ، لوحظ انخفاض حاد في قيم CI عندما أصيبت HUVECs ب ZIKV P6-740 عند MOI من 0.1 و 1. الانخفاض الحاد في قيمة CI ، مما يشير إلى أن التغيرات المورفولوجية الخلوية HUVEC حدثت بعد الإصابة ، وهذا أدى إلى تعطيل الوصلات الضيقة وسلامة الأوعية الدموية EC.

تقليديا ، يتم تقدير CPEs الناجمة عن العدوى الفيروسية للخلايا في المختبر بناء على الملاحظة المجهرية للخلايا المصابة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح بعض المقايسات الأخرى ، مثل مقايسة البلاك ، بتصور CPEs (مثل انفصال الخلايا) وتستخدم لقياس مدى CPEs42. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها قيود من حيث أنها توفر فقط معلومات عن النقاط الزمنية المنفصلة للتغيرات المورفولوجية الخلوية (مقايسات نقطة النهاية). تعتمد المقايسات الأخرى ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، على مجموعات من الأجسام المضادة المحددة الموسومة بالفلوروفور لتصور التغيرات المورفولوجية43. على الرغم من أن مقايسة التألق المناعي لديها قدرة واسعة تسمح بتصور العديد من المكونات في أي نسيج أو نوع معين من الخلايا ، إلا أن هذه التقنية لا تسمح بالمراقبة والكشف في الوقت الفعلي أثناء العدوى الفيروسية. في المقابل ، يسجل نظام RTCA التغيرات المورفولوجية للخلايا في الوقت الفعلي أثناء العدوى الفيروسية ، مما يسمح بالتقاط التأثيرات العابرة ، مثل تسرب الأوعية الدموية العابر ، والتي يمكن تفويتها بواسطة فحوصات نقطة النهاية. على سبيل المثال ، ستفشل فحوصات نقطة النهاية في اكتشاف البيانات والتغيرات المورفولوجية في وقت مبكر من 60 HPI و 80 HPI و 100 HPI. بالإضافة إلى RTCA ، يعد قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) طريقة أخرى شائعة الاستخدام لمراقبة التفاعلات من خلية إلى خلية ، حيث يتم قياس المقاومة الكهربائية عبر الطبقة الأحادية للخلية. ومع ذلك، يتطلب TEER عدة قياسات متكررة بمرور الوقت من أجل مراقبة أنشطة الخلايا الحية وغالبا ما يتم إجراؤه على عدد أقل من العينات أو الآبار في وقت واحد. نتيجة لذلك ، عادة ما يكون لدى TEER إنتاجية أقل مقارنة ب RTCA ، والتي يمكن أن تدير ما يصل إلى 96 بئرا في وقت واحد44.

على الرغم من فوائده ، فإن نظام RTCA له العديد من القيود. القيد الرئيسي لنظام RTCA هو المعدات والمواد الاستهلاكية المكلفة. تعتبر ألواح الأقطاب الكهربائية الدقيقة الذهبية المتخصصة التي يستخدمها نظام RTCA مكلفة نسبيا وتستخدم مرة واحدة ويمكن التخلص منها45. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تصوير التغيرات المورفولوجية للخلية والتقاطها على مسجل (كاميرا) ، ولا يمكن للفحص التقاط تراكم مستضد الفيروس أو التغيرات في بروتين سطح الخلية ، مثل VE-cadherin في HUVECs46. نتيجة لذلك ، لا يمكن ل RTCA تصور التغيرات المورفولوجية للخلية التي من شأنها أن توفر معلومات مفيدة إضافية لتوضيح التسبب في المرض. أثناء الفحص أو إنشاء النموذج ، سيكون التحقق الإضافي من التلوين ، مثل تلطيخ VE-cadherin ل HUVECs ، مفيدا للتحقق من صحة القياسات التي تم الحصول عليها. علاوة على ذلك ، يقتصر نظام RTCA على خطوط الخلايا الملتصقة ، حيث يتطلب ربط الخلايا في قاع الآبار لتسجيل المعاوقة. لذلك ، لا يمكن استخدام الفحص المبلغ عنه لخطوط الخلايا غير الملتصقة46.

في الختام ، وصفنا بروتوكول تحليل الخلايا في الوقت الفعلي باستخدام أداة RTCA لمراقبة التغيرات في الخلايا البطانية عند الإصابة بفيروس ZIKV بتنسيق 96 بئرا. توفر هذه الطريقة العديد من المزايا مقارنة بمقايسات نقطة النهاية التقليدية ، من حيث أنها تسمح بنهج مكثف غير جراحي وغير موسمي للمراقبة المستمرة للتغيرات المورفولوجية الخلوية في الوقت الفعلي. يمكن أيضا استخدام هذا الفحص لتحليل تغيرات سلامة الأوعية الدموية لخطوط الخلايا الأخرى في إعدادات تجريبية مختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تلقى هذا البحث دعما من وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار برنامج مركز التميز للمؤسسات العليا (HICoE) (MO002-2019) والتمويل في إطار برنامج المنح البحثية طويلة الأجل (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN / F1 / 01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Tags

علم الأحياء ، العدد 195 ، الخلايا البطانية الوريدية للوريد السري البشري ، العدوى الفيروسية ، القائمة على المعاوقة ، تحليل الخلايا في الوقت الفعلي ، الخلايا البطانية ، الحاجز ، تبادل السوائل ، تبادل المذاب ، انتشار الفيروس ، نفاذية البطانية ، اضطراب حاجز الخلية البطانية ، تسرب الأوعية الدموية ، محلل الخلايا في الوقت الفعلي ، عدوى فيروس زيكا (ZIKV) ، مؤشر الخلية (CI) ، التأثيرات العابرة ، التغيرات المورفولوجية للخلية ، سلامة الأوعية الدموية
مراقبة التغيرات في الخلايا البطانية الوريدية للوريد السري البشري عند الإصابة الفيروسية باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar,… More

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter