Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניטור השינויים בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) במהלך זיהום ויראלי באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA).

Abstract

תאי אנדותל מצפים את פני השטח הפנימיים של כל כלי הדם והלימפה, ויוצרים מחסום חדיר למחצה המווסת את חילופי הנוזלים והמומסים בין הדם או הלימפה לבין הרקמות הסובבות אותם. יכולתו של וירוס לחצות את מחסום האנדותל היא מנגנון חשוב המאפשר הפצת וירוסים בגוף האדם. וירוסים רבים מדווחים כמשנים את חדירות האנדותל ו / או גורמים להפרעה במחסום תאי האנדותל במהלך ההדבקה, אשר מסוגלת לגרום לדליפת כלי דם. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA), המשתמש במנתח תאים מסחרי בזמן אמת כדי לעקוב אחר שלמות האנדותל ושינויים בחדירות במהלך זיהום נגיף זיקה (ZIKV) של תאי אנדותל ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). אותות העכבה שנרשמו לפני ואחרי זיהום ZIKV תורגמו לערכי אינדקס התא (CI) ונותחו. פרוטוקול RTCA מאפשר זיהוי של השפעות חולפות בצורה של שינויים מורפולוגיים התא במהלך זיהום ויראלי. בדיקה זו יכולה להיות שימושית גם לחקר שינויים בשלמות כלי הדם של HUVECs בתצורות ניסוי אחרות.

Introduction

תאי אנדותל (ECs) מצפים את פני השטח הפנימיים של כל כלי הדם והלימפה. הם מחוברים על ידי דבקים, צמתים פער הדוק, יצירת מחסום חדיר למחצה בין הדם או הלימפה לבין הרקמות שמסביב 1,2. צמתי תאי האנדותל השלמים הם קריטיים לוויסות ההובלה של מקרומולקולות, מומסים ונוזלים, החיוניים לפעילות הפיזיולוגית של הרקמות והאיברים המתאימים3. מחסום האנדותל הוא דינמי ומווסת על ידי גירויים ספציפיים4. הפרעה או אובדן של תפקוד מחסום האנדותל הוא סימן היכר של פתופיזיולוגיה של מחלות בדלקת חריפה וכרונית בפתוגנזה של מחלות רבות 5,6,7, כולל זיהום ויראלי 8,9,10,11. עבור flaviviruses, נמצא כי חלבון לא מבני NS1 יכול לשנות את חדירות האנדותל, למשל, באמצעות הפרעה של שכבת האנדותל דמוי glycocalyx כתוצאה של ביטוי מוגבר והפעלה של cathepsin L, sialidases, ו endoglycosidase heparinase9. במצב המחלה, שלמות החד-שכבה של האנדותל נפגעת, וצמתים בין תאים לתאים משתבשים, מה שעלול להוביל לפגיעה אנדותלותפקוד לקוי 12 ובסופו של דבר לביטויים פתולוגיים נרחבים על פני מערכות איברים מרובות13,14. זיהום ויראלי של ECs גורם לשינויים במסלולי האיתות התאיים ובפרופיל ביטוי הגנים התאיים, אשר עשויים להשפיע על תפקודי מחסום הנוזל, לגרום לשיבוש של ECs, ולגרום דליפת כלי דם10,15. זיהום בנגיף זיקה (ZIKV) של ECs נמצא כמשבש את שלמות הצומת הגורמת לשינויים בחדירות כלי הדם ומובילה לתפקוד לקוי של מחסום האנדותל, וכתוצאה מכך דליפת כלי דם10,15. מחקרים הראו כי ZIKV קשור למומים מולדים חמורים; עם זאת, לא הרבה ידוע על המנגנון המדויק שבו זה קורה16,17. לכן, הבנת השינויים במחסום האנדותל במהלך זיהום היא קריטית להבנת מנגנון המחלה.

ECs משמשים כיום כמערכת מודל כלי דם ניסיונית חשובה במבחנה עבור תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים 18,19,20,21. תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) שימשו באופן נרחב כמערכת תאים ראשונית, לא אימורטלית, לחקר אנדותל כלי הדם וביולוגיה של כלי הדם במבחנה 22,23,24,25. HUVECs בודדו לראשונה לתרבית חוץ גופית בתחילת שנות השבעים מווריד הטבור של חבל הטבור האנושי26. ל-HUVECs יש מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת שניתנת בקלות להתרבות במעבדה. בשל מתח גזירה לאחר שנשמר במשך תקופות ארוכות במצב המפגש, התארכות צורת התא הוא ציין. HUVECs יכול להיות מאופיין על ידי נוכחות של גופים Weibel ו Palade (WPB), שלפוחיות pinocytic, כמויות קטנות של סיבים הממוקם ליד הגרעין, מיטוכונדריה עם צורות צינוריות אשר לעתים רחוקות להראות השלכות, גרעין אליפסואידי עם תבנית גרגירית עדינה של כרומטין, ואחד עד שלושה גרעינים נוכחים בכל גרעין27. למרות ש- HUVECs מראים מאפיינים מורפולוגיים רבים, זיהוי HUVECs אינו יכול להיות מושג על ידי בדיקה אופטית בלבד. מבחנים, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית של אנדותל כלי דם (VE)-cadherin, משמש בדרך כלל לניטור שלמות כלי הדם ב- HUVECs 28,29,30,31.

מחקר זה מתאר את פרוטוקול ניתוח התאים בזמן אמת (RTCA) של זיהום HUVECs. מערכת RTCA משתמשת בלוחות מיוחדים מצופים זהב המכילים מיקרואלקטרודות המספקות משטח מוליך לחיבור התא. כאשר התאים נצמדים למשטח המיקרואלקטרודות, נוצר מחסום המעכב את זרימת האלקטרונים דרך המיקרואלקטרודות. מדידת העכבה הנוצרת על-ידי מיקרואלקטרודות יכולה לשמש להשגת מידע על תהליכים תאיים מסוימים, כולל התקשרות לתאים, התפשטות ונדידה32. הבדיקה המדווחת היא בדיקה תאית מבוססת עכבה אשר, יחד עם מנתח תאים בזמן אמת, מספקת מדידה רציפה של התפשטות תאים חיים, שינויים במורפולוגיה (כגון התכווצות תאים) ואיכות התקשרות התא באופן לא פולשני וללא תוויות. במחקר זה, מנתח תאים בזמן אמת משמש לניטור שלמות האנדותל ושינויים מורפולוגיים של HUVECs במהלך זיהום ZIKV. בקצרה, המכשיר מודד את זרימת האלקטרונים המועברת בלוחות מיקרוטיטר מיוחדים מצופים מיקרואלקטרודות זהב בנוכחות מדיום תרבית (תמיסה מוליכה חשמלית). היצמדות התא או שינויים במספר התא ובמורפולוגיה מפריעים לזרימת האלקטרונים וגורמים לשינויים בעכבה שיכולים להילכד על-ידי המכשיר (איור משלים 1). ההבדל בין צמיחת HUVEC, התפשטות והיצמדות לפני ואחרי זיהום ZIKV נרשם בזמן אמת על ידי אות עכבה חשמלית ולאחר מכן מתורגם לערך אינדקס התא (CI). ערך CI מלפני ההדבקה משמש כבסיס לנורמליזציה של ערך CI. השינויים בערכי CI משקפים שינויים מורפולוגיים תאיים או אובדן היצמדות תאים עם הזיהום33. תוצאות המחקר מראות כי פרוטוקול RTCA מאפשר זיהוי של השפעות חולפות או שינויים מורפולוגיים של התא במהלך זיהום ויראלי בהשוואה לבדיקת נקודות קצה, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית של VE-cadherin. שיטת RTCA יכולה להיות שימושית לניתוח השינויים בשלמות כלי הדם HUVEC בעת הדבקה על ידי וירוסים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים

  1. הכנת HUVECs
    1. לגדל 7.5 x 105 תאי HUVEC / מ"ל בבקבוק תרבית תאים בגודל 75 ס"מ2 (מצופה בקולגן מסוג 1 של 20 מיקרוגרם/מ"ל) המכיל 12 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), תוסף גדילת תאי אנדותל 0.01% (ECGS) המכיל גורמי גדילה, הורמונים וחלבונים הדרושים לתרבית HUVECs, ו-0.01% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). דגרו על התאים באינקובטור של תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 (איור 1).

2. הגדרת ניסוי RTCA

  1. אימות נגד פועל על RTCA
    1. לחץ פעמיים על סמל תוכנת RTCA בשולחן העבודה כדי להפעיל את היישום. יופיע חלון התחברות, הקלד את שם המשתמש והסיסמה כדי להתחבר.
    2. הניחו צלחת נגדי RTCA בעלת 96 בארות כאשר באר A1 פונה פנימה לתוך תחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.
    3. בכרטיסיה הערות הוצאה של תוכנת RTCA, הקלד את שם הניסוי, SN ההתקן וסוג ההתקן (לוחית QC).
    4. בכרטיסיה פריסה תחת הכרטיסייה תא של תוכנת RTCA, סמן את כל הבארות ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הבארות המסומנות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות (מעומעמות).
    5. בכרטיסיה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על Step_1. הזן מטאטא: 10, ומרווח: 30 שניות. לחץ על החל. לחץ על התחל/המשך בפינה הימנית העליונה של התוכנה כדי להתחיל בהפעלת האימות.
      הערה: ודא שחיבור הבארות לתחנת RTCA תקין על ידי התבוננות ב"לוח סרוק. חיבורים בסדר" בתחתית העמוד.
  2. הפעלת אימות נגד לניתוח נתונים
    1. בכרטיסיה אינדקס תאים , בדוק את הנתונים עם השלמת ההפעלה. כל ערכי CI צריכים להיות קטנים מ- 0.063.
    2. בחלק התחתון של הכרטיסיה אינדקס תאים , בדוק את נתוני הסריקה הגולמיים. נתוני הסריקה הגולמיים צריכים להציג תבניות ערכים חוזרות ונשנות של 40.0 ± 2.0 (שורות A ו- H), 67.5 ± 2.5 (שורות B ו- G), 93.6 ±- 2.9 (שורות C ו- F) ו- 117.6 ± 3.2 (שורות D ו- E).
    3. כדי לעצור את הפעלת האימות, לחץ על צלחת > צלחת שחרור. לוחית נגדי RTCA בעלת 96 בארות מוכנה כעת להסרה מתחנת RTCA.
  3. קבלת קריאת רקע על RTCA
    1. שטפו את צלחת המיקרואלקטרודות המוזהבת המיוחדת המצופה קולגן מסוג 1 (מצופה בקולגן מסוג 1 של 20 מיקרוגרם/מ"ל) עם 60 מיקרוליטר/באר של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS; עם סודיום ביקרבונט, ללא סידן כלורי ומגנזיום גופרתי) פי 2.
    2. השליכו את ה-HBSS הנותרים והוסיפו 50 μL/well של ECM. הניחו את לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת המכילה ECM כאשר באר A1 פונה פנימה לתחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.
    3. בכרטיסייה Exp Notes של תוכנת RTCA, הקלד את שם הניסוי, SN ההתקן וסוג ההתקן (תבנית 96 באר).
    4. בכרטיסייה פריסה תחת הכרטיסייה תא של תוכנת RTCA, סמן את הבארות שישמשו ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הבארות המסומנות כדי לוודא שכל הבארות מופעלות (מעומעמות).
    5. בכרטיסייה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על Step_1 ולחץ על התחל/המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה כדי לקבל קריאת רקע.
      הערה: ודא שהחיבור של הבארות נכון על ידי התבוננות "לוח סרוק. חיבורים בסדר" בתחתית העמוד.
    6. לאחר קבלת קריאת הרקע, לוח מיקרואלקטרודות הזהב המיוחד מוכן כעת לזריעת תאים ומוכן להסרה מתחנת RTCA.
  4. הכנת HUVEC בלוח הזהב-מיקרואלקטרודות המיוחד
    1. זרעו את HUVECs בלוח המיקרואלקטרודות הזהב המיוחד עם 50 μL / well של מדיום מותנה, 1 x 104 תאים / באר (מדיום מותנה: ECM בתוספת 10% FBS, 0.01% ECGS, ו 0.01% P / S). הניחו את הצלחת בחזרה לתחנת RTCA כאשר באר A1 פונה פנימה לדגירת לילה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2.
      הערה: בוצעה ספירת תאים בתרחיף התא עם מקדם דילול של שניים באמצעות המוציטומטר.
    2. בכרטיסיה לוח זמנים , לחץ על הוסף שלב בפינה הימנית העליונה. לחץ על Step_2 ושנה את המטאטא: 601, ומרווח: 2 דקות. לחץ על החל. לחץ על Step_2 ולחץ על התחל/המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה.
    3. לאחר 20 שעות של דגירה וכאשר ערכי CI בכרטיסייה גרף באר מראים מישור, הצלחת מוכנה לזיהום. בכרטיסיה לוח זמנים של תוכנת RTCA, לחץ על בטל שלב.
    4. לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת מוכנה כעת להסרה מתחנת RTCA לשלבים הבאים.

3. זיהום ויראלי ב- HUVECs

  1. דילול וירוסים
    1. תרבות המניות ZIKV נשמרת ב -80 ° C. עבור מחקר זה, הסר את מלאי הנגיף שנשמר בבקבוקונים הקריוגניים ודלל את מלאי ZIKV עם ECM ללא סרום בצינורות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל כדי להשיג ריבוי זיהומים (MOIs) של 0.1 ו -1.
      הערה: מלאי ZIKV הוכן בעבר על ידי ביצוע ריבוי בתאי Vero וקצירת ZIKV supernatant34.
  2. זיהום של monolayer התא
    1. הסר והשלך את המדיום המותנה (ECM בתוספת 10% FBS, 0.01% ECGS ו- 0.01% P/S) מכל באר. יש לשטוף כל באר עם 60 μL של HBSS 2x. הכנס את HBSS בעזרת הצד של הבאר; אל תירה בתא monolayer.
    2. עבודה מהדילול הגבוה ביותר לנמוך ביותר, להוסיף 40 μL של כל דגימת וירוס מדולל ECM ללא סרום לתוך הבאר. לשלש את הבאר עבור כל דילול ולשמור על שש בארות ללא זיהום (שליטה שלילית ושליטה חיובית טרומבין). אל תירה את monolayer התא; במקום זאת, מוסיפים את הנגיף המדולל בעזרת הצד של הבאר. השתמשו בקצה פיפט טרי לכל החדרה.
      הערה: תרומבין נבחר כבקרה חיובית מכיוון שהוא יכול להגדיל את חדירות האנדותל של HUVECs במהירות.
    3. יש לדגור על הצלחת באינקובטור של תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 כדי לאפשר ספיחת וירוסים. מרחו את הצלחת 5 פעמים כל 15 דקות כדי לאפשר ספיחת וירוסים בכל שכבת התא.
  3. תוספת של מדיום תרבית תאים שכבת-על
    1. לאחר שעה אחת של דגירה, להסיר ולהשליך את ההשעיה וירוס מן הריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר.
    2. לשטוף את התאים הנגועים עם 60 μL של HBSS 2x. לכסות את הבאר עם ECM בתוספת 2% FBS. עבור בארות הבקרה החיוביות, לדלל את התרומבין ל 20 U/mL עם ECM בתוספת 2% FBS, ולכסות את הבארות עם מדיום ECM המכיל טרומבין. אל תירה את monolayer התא; במקום זאת, הוסיפו מדיה בשכבת-על בעזרת הצד של הבאר.
  4. מיקום לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הנגועה בחזרה לתחנת RTCA
    1. בכרטיסיה לוח זמנים , לחץ על הוסף שלב בפינה הימנית העליונה. לחץ על Step_3 ושנה את המטאטא: 3,601 ומרווח: 2 דקות. לחץ על החל.
    2. לחץ על OK בחלון המוקפץ שמופיע. הניחו את לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הנגועה עם באר A1 הפונה פנימה לתחנת RTCA הממוקמת באינקובטור תרביות התא.
    3. לחץ על Step_3 ולחץ על התחל/המשך בפינה השמאלית העליונה של התוכנה.

4. ניתוח נתונים וייצוא נתונים

  1. הוספת מידע ניסיוני של כל באר
    1. בכרטיסיה פריסה , לחץ על הכרטיסיה תא (איור 2A). כדי להזין את פרטי תא היעד ולקבוע את סוג הבאר עבור כל באר, סמן את הבאר והקלד את שם תא היעד, המספר והצבע בתחתית התוכנה. לחץ על החל (איור 2B).
    2. כדי לבחור ולקבוע את סוג הבאר עבור כל באר בכרטיסיה תא , סמן את הבאר, בחר סוג באר (מדגם, בקרה חיובית או בקרה שלילית) ולחץ על הגדר.
    3. בכרטיסייה פריסה , לחצו על הכרטיסייה טיפול (איור 2C). כדי להזין את פרטי הטיפול, סמן את הבאר והקלד את שם הטיפול, ריכוז הטיפול, היחידה והצבע. לחץ על החל (איור 2D).
    4. כדי לבחור ולקבוע את סוג הבאר עבור כל באר בכרטיסיה טיפול , סמן את הבאר, בחר סוג באר (דגימה, בקרה חיובית או בקרה שלילית) ולחץ על הגדר.
      הערה: עבור כל בחירה, ניתן להדגיש בארות מרובות בו-זמנית.
  2. נורמליזציה של ערך CI
    1. לחץ לחיצה ימנית משמאל לכרטיסייה ניתוח נתונים ובחר אינדקס תאים מנורמל מהתיבה הנפתחת ציר Y (איור 3A). באזור ציר X בתחתית, בחרו את הזמן המנורמל כנקודת הזמן האחרונה שנמדדה שבה לוחית מיקרואלקטרודת הזהב המיוחדת הוסרה לצורך זיהום (איור 3B).
      הערה: תהליך הנורמליזציה המבוצע על ידי התוכנה מסיר את רוב השונות בשל ההבדלים בזריעה ובהתקשרות היטב, כל עוד נקודת הנורמליזציה שנבחרה היא לפני הוספת הנגיף ו / או הטיפול. לפיכך, נקודת הזמן האופטימלית לנורמליזציה צריכה להיות נקודת הזמן האחרונה לפני הוספת הנגיף ו / או הטיפול. ניתן לבדוק את נקודת הזמן לנרמול בכרטיסיה לוח זמנים תחת Step_2. הזמן הכולל המצוין הוא נקודת הזמן לנורמליזציה (איור 3C).
  3. התוויית נתונים שהושגו באמצעות תוכנת RTCA
    1. בכרטיסייה ניתוח נתונים , בחר את הבארות שיש להוסיף לגרף על-ידי סימון הבארות ולחיצה << הוסף. אינדקס התאים המנורמל כנגד גרף הזמן מוכן כעת להעתקה ולייצוא. הקפד/י לסמן את תיבת הסימון ״ממוצע ״.
  4. ייצוא נתונים באמצעות תוכנת RTCA
    1. בפינה השמאלית העליונה של תוכנת RTCA, לחץ על Plate > Export Experiment Info.... סמן את התיבה כדי לבחור את הנתונים לייצא. לחץ על אישור.
      הערה: ניתן לייצא נתונים גולמיים (ערכי CI גולמיים) כאשר Cell index > All מסומן.
    2. בחר את התיקיה כדי לשמור את קובץ הייצוא. לחץ על שמור. יופיע חלון מוקפץ המציין ייצוא של מידע ניסיוני. לאחר סיום הייצוא, יופיע חלון נוסף המציין שמידע הניסוי המיוצא מוכן לצפייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפני ההדבקה ב-ZIKV, ה-CI שנרשם עבור החד-שכבה HUVEC בתרבית על לוחית מיקרו-אלקטרודה מיוחדת מצופה מיקרו-אלקטרודה היה מעל 8, מה שמרמז על תכונות היצמדות חזקות. יש להשליך צלחות או בארות עם מדד CI נמוך מ-8. לאחר מכן ה-HUVECs נדבקו ב-ZIKV ב-MOI של 0.1 ו-1, ועכבת התאים נרשמה במשך 7 ימים. ערך CI של HUVECs נגועים ZIKV P6-740 ב MOI של 0.1 (קו כחול בהיר) התחיל לרדת 15 שעות לאחר ההדבקה (HPI), בהשוואה בקרת זיהום שלילית (קו חום; איור 4). באשר ל- HUVECs שנדבקו במינון גבוה יותר של ZIKV P6-740 ב- MOI של 1 (קו כחול), ערך CI החל לרדת כבר ב- 11 HPI. ב-24 HPI, חלה ירידה של 5% ו-7% בערך ה-CI המנורמל (0.949, 0.929) כאשר ECs נדבקו ב-ZIKV ב-MOI של 0.1 ו-1, בהתאמה. ירידה של 50% בערך CI המנורמל נרשמה ב 96 HPI וב 66.75 HPI עם זיהום ZIKV ב MOI של 0.1 ו 1, בהתאמה. ערך CI מנורמל הגיע לנקודה הנמוכה ביותר שלו ב 107 HPI, שם הייתה ירידה של 51% ו 60% (0.4915, 0.3984) עם זיהום ZIKV ב MOI של 0.1 ו 1, בהתאמה. ערך CI מנורמל נמצא עלייה של 4% ו -13% מ 107 HPI ואילך עד סוף הניסוי ב 168 HPI (0.5128, 0.4571). הקו השחור מראה את ההשפעות של תרומבין המשמש כבקרה חיובית, כאשר ערכי CI נותרו נמוכים לאורך כל הניסוי, מחקים הפרעה של צמתים הדוקים, וגרם לדליפה וסקולרית35.

Figure 1
איור 1: תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). האיור הוא בהגדלה של פי 40 כדי להציג את קצב המפגש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צילומי מסך של הכרטיסיה תא וטיפול תחת הכרטיסייה פריסה בתוכנת RTCA. (A) בכרטיסיה פריסה , לחץ על הכרטיסייה תא . (B) כדי להזין מידע על תא היעד ולקבוע את סוג הבאר עבור כל באר, סמן את הבאר והקלד את שם תא היעד, המספר והצבע בתחתית התוכנה. לחץ על החל. (C) לחץ על הכרטיסייה פריסה תחת הכרטיסייה טיפול . (D) כדי להזין מידע טיפולי, סמן את הבאר והקלד את שם הטיפול, ריכוז הטיפול, היחידה והצבע. לחץ על החל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צילומי מסך של הכרטיסיה ניתוח נתונים בתוכנת RTCA לנורמליזציה של אינדקס תאים. (A) בתיבה הנפתחת ציר Y , בחר אינדקס תאים מנורמל. (B) במקטע ציר X , בחר את זמן הנורמליזציה. (C) צילום מסך של הכרטיסיה 'לוח זמנים' בתוכנת RTCA. זמן הנורמליזציה מצוין בזמן הכולל Step_2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אינדקס תאים מנורמל לעומת תרשים זמן של זיהום בנגיף זיקה (ZIKV) בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). לוח המיקרואלקטרודות המוזהב המיוחד היה מצופה בקולגן מסוג 1 של 20 מיקרוגרם/מ"ל. HUVECs נזרעו בצפיפות של 1.0 x 104 תאים / באר. ZIKV P6-740 (MOI: 0.1, 1) שימש לזיהום. תכלת: ZIKV P6-740 (MOI: 0.1); כחול: ZIKV P6-740 (MOI: 1); שחור: טרומבין כשליטה חיובית (20 U/mL); בראון: בקרת זיהום שלילית. כל נקודת נתונים מסמלת את הממוצע ונותחה בשלשה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ציור סכמטי על הטכניקה המשמשת בעכבת הביו-חיישנים החשמליים RTCA. מבט צדדי על צלחת הבאר; בתחתית הבארות יש מסופים שליליים וחיוביים מצופים זהב. כאשר המכשיר מודד CI במיקרו-באר המכילה מדיה תרבותית המאפשרת להוליך חשמל, האלקטרון זורם מהשלילי למסוף החיובי. כאשר מדובר בבקרה ריקה, זרימת האלקטרונים חלקה, ולכן לא נרשמת עכבה. כאשר התאים נזרעים, וככל שיותר ויותר תאים נצמדים לתחתית הבאר, עכבה בזרימת אלקטרונים קיימת ונועדת על ידי המחשב. באמצעות ערך עכבה זה, המכשיר ממיר אותו לערך CI, המציין את מספר התאים המחוברים לתחתית הבאר (הידבקות). נוצר באמצעות BioRender. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהום נגיפי ציטוקידי בתאים מתירניים קשור בדרך כלל לשינויים משמעותיים במורפולוגיה של התא וביוסינתזה36. השינויים המורפולוגיים התאיים הנגרמים על ידי הנגיף, כגון התכווצות תאים, הגדלת תאים ו / או היווצרות סינסיטיה, ידועים גם בשם השפעות ציטופתיות (CPEs), האופייניות לזיהומים ויראליים מסוימים37. ב-ECs, ה-CPE תואר כהרס התאים והתמוטטות הצמתים הצפופים בין כל EC, ובכך גרם להתמוטטות מחסום האנדותל38,39. CPEs ב- HUVECs יכולים להיות מתוארים כניתוק תאים חד-שכבתיים וצפים מכלי תרבית הרקמה. השינויים המורפולוגיים של התא הנגוע, כגון ניתוק וציפה של תאים דבקים, ניתנים לזיהוי רציף באמצעות שיטת RTCA. טכניקה זו מבוססת על עכבה חשמלית, המאפשרת ניטור של תאים בזמן אמת עד כל כמה שניות. הוא מאפשר כימות של התפשטות תאים, שינויים מורפולוגיים, ובמקרה של HUVECs, ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר שינויים בשלמות האנדותל ובתפקוד מחסום התא40 בעת הגירוי.

במחקר זה, השלב הקריטי הוא הגדרת הניסוי, שבו נעשה שימוש בלוח הנגד בעל 96 הקידוחים. זאת על מנת להבטיח כי כל החיבורים של המנתח מחוברים היטב לצלחת. ב- RTCA, ערך העכבה הנמדד מומר כערך CI כדי להבדיל בין ההבדלים במספר התא, דרגת ההיצמדות, המורפולוגיה התאית והכדאיות התא41. הירידה בעכבה המתועדת על ידי מנתח RTCA, המתורגמת לירידה בערך CI, מצביעה על מספר תאים מופחת, מידת הידבקות חלשה יותר, ושינויים משמעותיים במורפולוגיה התאית42. לכן, חשוב גם לבדוק את ההתאמה של קווי תאים ומספרי תאים אופטימליים לשימוש בניסוי RTCA. זה קריטי לקבוע אם ניתן להשיג את מדד CI הרצוי לפני ביצוע בדיקות על התאים באמצעות מערכת RTCA. בנוסף, זה גם עוזר לקבוע אם מערכת RTCA מתאימה לניטור צמיחת תאים ופרופילי מוות תאי של סוגי תאים נבחרים. במחקר שלנו, נצפתה ירידה תלולה בערכי CI כאשר HUVECs נדבקו ב-ZIKV P6-740 ב-MOI של 0.1 ו-1. הירידה התלולה בערך CI, מכאן מצביעה על כך ששינויים מורפולוגיים בתאי HUVEC התרחשו בעקבות זיהום, וזה הוביל לשיבוש של צמתים הדוקים ושלמות כלי הדם של EC.

באופן קונבנציונלי, CPEs הנגרמים על ידי זיהום ויראלי של תאים במבחנה נאמדים על סמך תצפית מיקרוסקופית של התאים הנגועים. בנוסף, כמה בדיקות אחרות, כגון בדיקת פלאק, מאפשרות הדמיה של CPEs (כגון ניתוק תאים) ומשמשות למדידת היקף CPEs42. עם זאת, לשיטות אלה יש מגבלות בכך שהן מספקות מידע רק על נקודות זמן בדידות של השינויים המורפולוגיים התאיים (מבחני נקודות קצה). בדיקות אחרות, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית, מסתמכות על שילובים של נוגדנים ספציפיים המתויגים עם פלואורופור כדי להמחיש את השינויים המורפולוגיים43. למרות שלבדיקת האימונופלואורסנציה יש יכולת רחבה המאפשרת הדמיה של רכיבים רבים בכל רקמה או סוג תא נתון, טכניקה זו אינה מאפשרת ניטור וזיהוי בזמן אמת במהלך זיהום ויראלי. לעומת זאת, מערכת RTCA מתעדת את השינויים המורפולוגיים של התא בזמן אמת במהלך הזיהום הנגיפי, ומאפשרת ללכוד השפעות חולפות, כגון דליפת כלי דם חולפת, שעלולות להתפספס על ידי בדיקות נקודות קצה. לדוגמה, מבחני נקודות קצה לא יצליחו לזהות את הנתונים ואת השינויים המורפולוגיים כבר ב- 60 HPI, 80 HPI ו- 100 HPI. בנוסף ל- RTCA, מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל (TEER) היא שיטה נפוצה נוספת לניטור אינטראקציות בין תאים, שבה נמדדת ההתנגדות החשמלית על פני חד-שכבת התא. עם זאת, ה-TEER דורש מספר מדידות חוזרות ונשנות לאורך זמן על מנת לנטר פעילויות של תאים חיים, ולעתים קרובות הוא מבוצע על מספר קטן יותר של דגימות או בארות בכל פעם. כתוצאה מכך, ל-TEER יש בדרך כלל תפוקה נמוכה יותר בהשוואה ל-RTCA, שיכול להריץ עד 96 בארות בו זמנית44.

למרות היתרונות שלה, למערכת RTCA יש מספר מגבלות. המגבלה העיקרית של מערכת RTCA היא הציוד והחומרים המתכלים היקרים. לוחות מיקרואלקטרודות הזהב המיוחדים המשמשים את מערכת RTCA הם יקרים יחסית, חד פעמיים וחד פעמיים45. בנוסף, השינויים המורפולוגיים של התא אינם ניתנים לצילום וללכידה במקליט (מצלמה), וגם הבדיקה אינה יכולה ללכוד את הצטברות האנטיגן של הנגיף או שינויים בחלבון פני התא, כגון VE-cadherin ב- HUVECs46. כתוצאה מכך, RTCA אינו יכול לדמיין את השינויים המורפולוגיים של התא שיספקו מידע שימושי נוסף כדי להבהיר את הפתוגנזה של המחלה. במהלך הבדיקה או הקמת הדגם, אימות צביעה נוסף, כגון צביעת VE-cadherin עבור HUVECs, יהיה שימושי כדי לאמת את המדידות המתקבלות. יתר על כן, מערכת RTCA מוגבלת לקווי תאים דבקים, מכיוון שהיא דורשת חיבור של תאים בתחתית הבארות כדי שהעכבה תיקלט. לכן, לא ניתן להשתמש בבדיקה המדווחת עבור קווי תאים שאינם דבקים46.

לסיכום, תיארנו פרוטוקול ניתוח תאים בזמן אמת באמצעות מכשיר RTCA כדי לעקוב אחר שינויים בתאי אנדותל בעת זיהום ZIKV בפורמט 96 בארות. שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני בדיקות קונבנציונליות של נקודות קצה, בכך שהיא מאפשרת גישה לא פולשנית ולא אינטנסיבית לניטור רציף של שינויים מורפולוגיים תאיים בזמן אמת. בדיקה זו יכולה לשמש גם לניתוח שינויים בשלמות כלי הדם של קווי תאים אחרים במערכי ניסוי שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה קיבל תמיכה ממשרד ההשכלה הגבוהה מלזיה במסגרת תוכנית מרכז המצוינות למוסדות גבוהים (HICoE) (MO002-2019) ומימון במסגרת תוכנית מענקי המחקר לטווח ארוך (LRGS MRUN שלב 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Tags

ביולוגיה גיליון 195 תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים זיהום ויראלי מבוסס עכבה ניתוח תאים בזמן אמת תאי אנדותל מחסום חילופי נוזלים חילופי מומסים הפצת וירוסים חדירות אנדותל הפרעה במחסום תאי אנדותל דליפת כלי דם מנתח תאים בזמן אמת זיהום בנגיף זיקה (ZIKV) אינדקס תאים (CI) השפעות חולפות שינויים מורפולוגיים של תאים שלמות כלי הדם
ניטור שינויים בתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי בעת זיהום ויראלי באמצעות ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar,… More

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter