Summary
Den aktuella studien beskriver ett protokoll för att övervaka förändringarna i humana endotelceller i navelvenen (HUVEC) under virusinfektion med hjälp av ett system för cellanalys i realtid (RTCA).
Abstract
Endotelceller kantar den inre ytan av alla blod- och lymfkärl och skapar en semipermeabel barriär som reglerar vätske- och löst utbyte mellan blod eller lymfa och deras omgivande vävnader. Ett virus förmåga att passera endotelbarriären är en viktig mekanism som underlättar virusspridning i människokroppen. Många virus rapporteras förändra endotelpermeabiliteten och/eller orsaka endotelcellsbarriärstörning under infektion, vilket kan orsaka vaskulärt läckage. Den aktuella studien beskriver ett protokoll för cellanalys i realtid (RTCA), med hjälp av en kommersiell cellanalysator i realtid för att övervaka endotelintegritet och permeabilitetsförändringar under zikavirusinfektion (ZIKV) i humana endotelceller i navelvenen (HUVEC). Impedanssignalerna som registrerades före och efter ZIKV-infektion översattes till cellindexvärden (CI) och analyserades. RTCA-protokollet gör det möjligt att upptäcka övergående effekter i form av cellmorfologiska förändringar under en virusinfektion. Denna analys kan också vara användbar för att studera förändringar i den vaskulära integriteten hos HUVEC i andra experimentella uppställningar.
Introduction
Endotelceller (EC) kantar den inre ytan av alla blod- och lymfkärl. De är förbundna med vidhäftningar, täta spaltkorsningar, vilket skapar en semipermeabel barriär mellan blod eller lymfa och de omgivande vävnaderna 1,2. De intakta endotelcell-cell-korsningarna är avgörande för att reglera transporten av makromolekyler, lösta ämnen och vätskor, avgörande för de fysiologiska aktiviteterna hos motsvarande vävnader och organ3. Endotelbarriären är dynamisk och moduleras av specifika stimuli4. Störning eller förlust av endotelbarriärfunktion är ett kännetecken för sjukdomens patofysiologi vid akut och kronisk inflammation i patogenesen av många sjukdomar 5,6,7, inklusive virusinfektion 8,9,10,11. För flavivirus visade det sig att det icke-strukturella proteinet NS1 kan förändra endotelpermeabiliteten, till exempel genom störning av det endotelliknande glykokalyxliknande skiktet som ett resultat av ökat uttryck och aktivering av cathepsin L, sialidaser och endoglykosidasheparinas9. I sjukdomstillståndet påverkas integriteten hos endotelmonolagret och cell-cell-korsningar störs, vilket kan leda till endotelskada och dysfunktion12 och så småningom utbredda patologiska manifestationer i flera organsystem 13,14. Virusinfektion av ECs resulterar i förändringar i cellsignalvägarna och cellulära genuttrycksprofilen, vilket kan påverka vätskebarriärfunktionerna, orsaka störningar i EC och inducera vaskulärt läckage10,15. Zikavirusinfektion (ZIKV) av EC har visat sig störa korsningsintegriteten som orsakar förändringar i vaskulär permeabilitet och leder till endotelbarriärdysfunktion, vilket resulterar i vaskulärt läckage10,15. Studier har visat att ZIKV är kopplat till allvarliga fosterskador; Inte mycket är dock känt om den exakta mekanismen genom vilken detta sker 16,17. Att förstå endotelbarriärförändringar under en infektion är därför avgörande för att förstå sjukdomsmekanismen.
EC används för närvarande som ett viktigt experimentellt in vitro vaskulärt modellsystem för olika fysiologiska och patologiska processer 18,19,20,21. Humana navelvenendotelceller (HUVEC) har använts i stor utsträckning som ett primärt, icke-odödligt cellsystem för att studera vaskulärt endotel och vaskulär biologi in vitro 22,23,24,25. HUVECs isolerades först för in vitro-odling i början av 1970-talet från navelvenen i den mänskliga navelsträngen26. HUVECs har en kullerstensliknande morfologi som lätt kan fås att föröka sig i laboratoriet. På grund av skjuvspänning efter att ha bibehållits under långa perioder i konfluentt tillstånd observeras förlängning av cellformen. HUVEC kan karakteriseras av närvaron av Weibel- och Palade-kroppar (WPB), pinocytiska vesiklar, små mängder fibriller belägna nära kärnan, mitokondrier med rörformiga former som sällan visar förgreningar, en ellipsoid kärna med ett fint granulärt mönster av kondenserat kromatin och en till tre nukleoler närvarande i varje kärna27. Även om HUVEC uppvisar många morfologiska egenskaper, kan identifieringen av HUVEC inte uppnås enbart genom optisk undersökning. Analyser, såsom immunofluorescensfärgning av vaskulär endotel (VE)-cadherin, används ofta för övervakning av vaskulär integritet i HUVEC 28,29,30,31.
Denna studie beskriver protokollet för cellanalys i realtid (RTCA) för infektion av HUVEC. RTCA-systemet använder specialiserade guldbelagda plattor som innehåller mikroelektroder som ger en ledande yta för cellfästet. När cellerna fäster på mikroelektrodens yta bildas en barriär som hindrar elektronflödet genom mikroelektroderna. Mätning av impedansen som genereras av mikroelektroder kan användas för att få information om vissa cellulära processer, inklusive cellbindningar, proliferation och migration32. Den rapporterade analysen är en impedansbaserad cellulär analys som, tillsammans med en cellanalysator i realtid, ger kontinuerlig mätning av levande cellproliferation, morfologiförändringar (såsom cellkrympning) och cellbindningskvalitet på ett icke-invasivt och etikettfritt sätt. I denna studie används cellanalysatorn i realtid för att övervaka endotelintegriteten och morfologiska förändringar av HUVEC under ZIKV-infektion. Kortfattat mäter instrumentet elektronflödet som överförs i specialiserade guld-mikroelektrodbelagda mikrotiterplattor i närvaro av ett odlingsmedium (elektriskt ledande lösning). Cellvidhäftning eller förändringar i cellantal och morfologi stör elektronflödet och orsakar impedansvariationer som kan fångas upp av instrumentet (tilläggsfigur 1). Skillnaden mellan HUVEC-tillväxt, proliferation och följsamhet före och efter ZIKV-infektion registreras i realtid av en elektrisk impedanssignal och översätts sedan till cellindexvärde (CI). CI-värdet från förinfektionen används som baslinje för normalisering av CI-värdet. Förändringarna i CI-värden återspeglar cellulära morfologiska förändringar eller förlust av celladhesit vid infektionen33. Studieresultaten visar att RTCA-protokollet gör det möjligt att detektera transienta effekter eller cellmorfologiska förändringar under virusinfektion jämfört med en endpoint-analys, såsom immunofluorescensfärgning av VE-cadherin. RTCA-metoden kan vara användbar för att analysera HUVEC:s vaskulära integritet vid infektion med andra virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av celler
- Beredning av HUVEC
- Odla 7,5 x 105 HUVEC-celler/ml i en 75 cm2 (belagd med 20 μg/ml kollagen typ 1) cellodlingskolv innehållande 12 ml endotelcellmedium (ECM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 0,01 % endotelcellstillväxttillskott (EKG) som innehåller tillväxtfaktorer, hormoner och proteiner som är nödvändiga för odling av HUVEC, och 0,01 % penicillin-streptomycin (P/S). Inkubera cellerna i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 (figur 1).
2. Uppställning av RTCA-experimentet
- Verifiering av motstånd körs på RTCA
- Dubbelklicka på RTCA-programvaruikonen på skrivbordet för att starta programmet. Ett inloggningsfönster visas, skriv in användarnamn och lösenord för att logga in.
- Placera en 96-brunnars RTCA-motståndsplatta med A1-brunnen vänd inåt i RTCA-stationen i cellodlingsinkubatorn.
- På fliken Exp Notes i RTCA-programvaran skriver du experimentnamnet, enhetens SN och enhetstyp (QC-platta).
- På fliken Layout under fliken Cell i RTCA-programvaran, markera alla brunnar och högerklicka på de markerade brunnarna för att se till att alla brunnar är påslagna (nedtonade).
- På fliken Schema i RTCA-programvaran klickar du på Step_1. Ange Svep: 10 och Intervall: 30 s. Klicka på Använd. Klicka på Start/Fortsätt i det övre vänstra hörnet av programvaran för att starta verifieringskörningen.
OBS: Se till att anslutningen av brunnarna till RTCA-stationen är okej genom att observera "Plate Scanned. Anslutningar OK" längst ner på sidan.
- Verifieringskörning av motstånd för dataanalys
- På fliken Cellindex kontrollerar du data när körningen är klar. Alla CI-värden ska vara mindre än 0,063.
- I den nedre delen av fliken Cellindex kontrollerar du rådata för skanning. Rådata bör uppvisa upprepade värdemönster på 40,0 ± 2,0 (raderna A och H), 67,5 ± 2,5 (raderna B och G), 93,6 ± 2,9 (raderna C och F) och 117,6 ± 3,2 (raderna D och E).
- Om du vill stoppa verifieringskörningen klickar du på Platta > släppplatta. RTCA-motståndsplattan med 96 brunnar är nu redo att tas bort från RTCA-stationen.
- Få bakgrundsläsning om RTCA
- Tvätta kollagenet typ 1-belagd specialiserad guld-mikroelektrodplatta (belagd med 20 μg/ml kollagen typ 1) med 60 μL/brunn av Hanks balanserade saltlösning (HBSS; med natriumbikarbonat, utan kalciumklorid och magnesiumsulfat) 2x.
- Kassera återstående HBSS och tillsätt 50 μl/brunn ECM. Placera den specialiserade guld-mikroelektrodplattan som innehåller ECM med A1-brunnen vänd inåt i RTCA-stationen i cellodlingsinkubatorn.
- På fliken Exp Notes i RTCA-programvaran skriver du experimentnamnet, enhetens SN och enhetstyp (96-brunnsformat).
- På fliken Layout under fliken Cell i RTCA-programvaran, markera de brunnar som kommer att användas och högerklicka på de markerade brunnarna för att se till att alla brunnar är påslagna (nedtonade).
- På fliken Schema i RTCA-programvaran klickar du på Step_1 och klickar på Start/Fortsätt i det övre vänstra hörnet av programvaran för att få en bakgrundsläsning.
OBS: Se till att anslutningen av brunnarna är korrekt genom att observera "Plate Scanned. Anslutningar OK" längst ner på sidan. - När bakgrundsavläsningen har erhållits är den specialiserade guld-mikroelektrodplattan nu redo för cellsådd och redo att tas bort från RTCA-stationen.
- HUVEC-beredning i den specialiserade guld-mikroelektrodplattan
- Sådd av HUVECs i den specialiserade guld-mikroelektrodplattan med 50 μL/brunn konditionerat medium, 1 x 104 celler/brunn (konditionerat medium: ECM kompletterat med 10 % FBS, 0,01 % EKG och 0,01 % P/S). Sätt tillbaka plattan i RTCA-stationen med A1-brunnen vänd inåt för inkubation över natten i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .
OBS: En cellräkning utfördes på cellsuspensionen med en spädningsfaktor på två med hjälp av en hemocytometer. - På fliken Schema klickar du på Lägg till ett steg i det övre vänstra hörnet. Klicka på Step_2 och ändra Svep: 601 och Intervall: 2 min. Klicka på Använd. Klicka på Step_2 och klicka på Start/Fortsätt i det övre vänstra hörnet av programvaran.
- Efter 20 timmars inkubation och när CI-värdena i fliken Brunnsgraf visar en platå är plattan redo för infektion. På fliken Schema i RTCA-programvaran klickar du på Avbryt steg.
- Den specialiserade guld-mikroelektrodplattan är nu redo att tas bort från RTCA-stationen för efterföljande steg.
- Sådd av HUVECs i den specialiserade guld-mikroelektrodplattan med 50 μL/brunn konditionerat medium, 1 x 104 celler/brunn (konditionerat medium: ECM kompletterat med 10 % FBS, 0,01 % EKG och 0,01 % P/S). Sätt tillbaka plattan i RTCA-stationen med A1-brunnen vänd inåt för inkubation över natten i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .
3. Virusinfektion i HUVEC
- Utspädning av virus
- ZIKV-stamkulturen hålls vid -80 °C. För denna studie, avlägsna viruslagret som förvaras i de kryogena injektionsflaskorna och späd ZIKV-lagret med serumfri ECM i 1,5 ml centrifugrör för att uppnå multiplicitet av infektioner (MOI) på 0,1 och 1.
OBS: ZIKV-stammen framställdes tidigare genom att utföra förökning i Vero-celler och skörda ZIKV-supernatanten34.
- ZIKV-stamkulturen hålls vid -80 °C. För denna studie, avlägsna viruslagret som förvaras i de kryogena injektionsflaskorna och späd ZIKV-lagret med serumfri ECM i 1,5 ml centrifugrör för att uppnå multiplicitet av infektioner (MOI) på 0,1 och 1.
- Infektion i cellmonolagret
- Ta bort och kassera det konditionerade mediet (ECM kompletterat med 10 % FBS, 0.01 % EKG och 0.01 % P/S) från varje brunn. Skölj varje väl med 60 μL HBSS 2x. Sätt i HBSS med hjälp av brunnens sida; Skjut inte cellens monolager.
- Tillsätt 40 μl av varje utspätt virusprov i serumfri ECM i brunnen från den högsta till den lägsta spädningen. Triplica brunnen för varje spädning och upprätthåll sex brunnar utan infektion (negativ kontroll och positiv kontrolltrombin). Skjut inte cellens monolager; Tillsätt istället det utspädda viruset med hjälp av sidan av brunnen. Använd en ny pipettspets för varje insättning.
OBS: Trombin valdes som den positiva kontrollen eftersom det snabbt kan öka endotelpermeabiliteten hos HUVEC. - Inkubera plattan i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 för att tillåta virusadsorption. Svep plattan 5 gånger var 15:e minut för att tillåta virusadsorption i hela cellmonolagret.
- Tillsats av det överlagrade cellodlingsmediet
- Efter 1 timmes inkubation avlägsnas virussuspensionen från den lägsta koncentrationen till den högsta och kasseras.
- Tvätta de infekterade cellerna med 60 μL HBSS 2x. Överlägg brunnen med ECM kompletterat med 2% FBS. För de positiva kontrollbrunnarna, späd trombinet till 20 E/ml med ECM kompletterat med 2 % FBS och täck brunnarna med trombininnehållande ECM-medium. Skjut inte cellens monolager; Lägg istället till överlagringsmedia med hjälp av sidan av brunnen.
- Placering av den infekterade specialiserade guld-mikroelektrodplattan tillbaka i RTCA-stationen
- På fliken Schema klickar du på Lägg till ett steg i det övre vänstra hörnet. Klicka på Step_3 och ändra Svep: 3 601 och Intervall: 2 min. Klicka på Använd.
- Klicka på OK i popup-fönstret som visas. Placera den infekterade specialiserade guldmikroelektrodplattan med A1-brunnen vänd inåt i RTCA-stationen i cellodlingsinkubatorn.
- Klicka på Step_3 och klicka på Start/Fortsätt i det övre vänstra hörnet av programvaran.
4. Dataanalys och export av data
- Tillägg av experimentell information för varje brunn
- På fliken Layout klickar du på fliken Cell (bild 2A). För att ange målcellinformationen och bestämma brunnstypen för varje brunn, markera brunnen och skriv in målcellens namn, nummer och färg längst ner i programvaran. Klicka på Verkställ (bild 2B).
- Om du vill välja och bestämma brunnstypen för varje brunn på fliken Cell markerar du brunnen, väljer brunnstyp (prov, positiv kontroll eller negativ kontroll) och klickar på Ange.
- På fliken Layout (Layout ) klickar du på fliken Treatment (Behandling (bild 2C). För att ange behandlingsinformation, markera brunnen och skriv in behandlingsnamn, behandlingskoncentration, enhet och färg. Klicka på Verkställ (bild 2D).
- Om du vill välja och bestämma brunnstypen för varje brunn på fliken Behandling markerar du brunnen, väljer brunnstyp (prov, positiv kontroll eller negativ kontroll) och klickar på Ställ in.
OBS: För varje val kan flera brunnar markeras samtidigt.
- Normalisering av CI-värde
- Högerklicka till höger på fliken Dataanalys och välj Normaliserat cellindex i listrutan Y-axel (bild 3A). I avsnittet X-axeln längst ned väljer du den normaliserade tiden som den senast uppmätta tidpunkten då den specialiserade guldmikroelektrodplattan togs bort för infektion (Figur 3B).
OBS: Normaliseringsprocessen som utförs av programvaran tar bort det mesta av variabiliteten på grund av skillnaderna i brunnssådd och fastsättning, så länge den valda normaliseringspunkten är före tillsats av viruset och/eller behandlingen. Därför bör den optimala normaliseringstidpunkten vara den sista tidpunkten före virus- och/eller behandlingstillägg. Tidpunkten för normalisering kan kontrolleras på fliken Schema under Step_2. Den totala tiden som anges är tidpunkten för normalisering (figur 3C).
- Högerklicka till höger på fliken Dataanalys och välj Normaliserat cellindex i listrutan Y-axel (bild 3A). I avsnittet X-axeln längst ned väljer du den normaliserade tiden som den senast uppmätta tidpunkten då den specialiserade guldmikroelektrodplattan togs bort för infektion (Figur 3B).
- Plotta erhållna data med hjälp av RTCA-programvara
- På fliken Dataanalys väljer du de brunnar som ska läggas till i diagrammet genom att markera brunnarna och klicka på << Lägg till. Det normaliserade cellindexet mot tidsdiagrammet är nu redo att kopieras och exporteras. Se till att markera kryssrutan Genomsnitt .
- Exportera data med RTCA-programvara
- I det övre vänstra hörnet av RTCA-programvaran klickar du på Plate > Export Experiment Info.... Markera rutan för att välja de data som ska exporteras. Klicka på OK.
OBS: Rådata (råa CI-värden) kan exporteras när Cellindex > Alla är markerat. - Välj mappen för att spara exportfilen. Klicka på SPARA. Ett popup-fönster visas som anger export av experimentell information. När exporten är klar visas ett annat fönster som anger att den exporterade experimentinformationen är redo att visas.
- I det övre vänstra hörnet av RTCA-programvaran klickar du på Plate > Export Experiment Info.... Markera rutan för att välja de data som ska exporteras. Klicka på OK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före ZIKV-infektion var CI som registrerades för HUVEC-monolagret odlat på en specialiserad guld-mikroelektrodbelagd mikrotiterplatta över 8, vilket tyder på starka vidhäftningsegenskaper. Plattor eller brunnar med ett CI-index mindre än 8 ska kasseras. HUVECs infekterades sedan med ZIKV vid ett MOI på 0,1 och 1, och cellimpedansen registrerades i 7 dagar. CI-värdet för HUVEC infekterade med ZIKV P6-740 vid en MOI på 0,1 (ljusblå linje) började sjunka 15 timmar efter infektion (HPI), jämfört med den negativa infektionskontrollen (brun linje; Figur 4). När det gäller HUVEC infekterade med en högre dos av ZIKV P6-740 vid en MOI på 1 (blå linje) började CI-värdet sjunka redan vid 11 HPI. Vid 24 HPI minskade det normaliserade CI-värdet med 5 % och 7 % (0,949, 0,929) när EC infekterades med ZIKV vid ett MOI på 0,1 respektive 1. En 50-procentig minskning av det normaliserade CI-värdet registrerades vid 96 HPI och vid 66,75 HPI vid ZIKV-infektion vid en MOI på 0,1 respektive 1. Det normaliserade CI-värdet nådde sin lägsta punkt vid 107 HPI, där det var en minskning med 51 % och 60 % (0,4915, 0,3984) vid ZIKV-infektion vid en MOI på 0,1 respektive 1. Det normaliserade CI-värdet visade sig ha en ökning på 4 % och 13 % från 107 HPI och framåt till slutet av experimentet vid 168 HPI (0,5128, 0,4571). Den svarta linjen visar effekterna av trombin som används som en positiv kontroll, där CI-värdena förblev låga under hela experimentet, vilket efterliknar störningen av täta korsningar och inducerat vaskulärt läckage35.
Figur 1: Humana endotelceller i navelvenen (HUVEC). Figuren är i 40x förstoring för att se sammanflödeshastigheten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Skärmbilder av fliken Cell och behandling under fliken Layout i RTCA-programvaran. (A) På fliken Layout klickar du på fliken Cell . (B) För att ange målcellinformation och bestämma brunnstypen för varje brunn, markera brunnen och skriv målcellens namn, nummer och färg längst ner i programvaran. Klicka på Använd. (C) Klicka på fliken Layout under fliken Behandling . (D) För att ange behandlingsinformation, markera brunnen och skriv in behandlingsnamn, behandlingskoncentration, enhet och färg. Klicka på Använd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Skärmbilder av fliken Dataanalys i RTCA-programvaran för normalisering av cellindex. (A) I listrutan Y-axel väljer du Normaliserat cellindex. (B) I avsnittet X-axel väljer du normaliseringstiden. (C) Skärmdump av fliken Schema i RTCA-programvaran. Normaliseringstiden anges vid den Step_2 totala tiden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Normaliserat cellindex kontra tidsdiagram för zikavirusinfektion (ZIKV) i humana endotelceller i navelvenen (HUVEC). Den specialiserade guld-mikroelektrodplattan var belagd med 20 μg/ml kollagen typ 1. HUVECs såddes med en densitet av 1,0 x 104 celler/brunn. ZIKV P6-740 (MOI: 0,1, 1) användes mot infektion. Ljusblå: ZIKV P6-740 (MOI: 0,1); blå: ZIKV P6-740 (MOI: 1); svart: trombin som positiv kontroll (20 E/ml); Brun: Negativ infektionskontroll. Varje datapunkt betecknar medelvärdet och analyserades i tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Schematisk ritning över den teknik som används i den elektriska biosensorimpedansbaserade RTCA. En sidovy av brunnsplattan; I botten av brunnarna finns guldpläterade negativa och positiva terminaler. Eftersom instrumentet mäter CI i mikrobrunnen som innehåller odlingsmedia som gör det möjligt att leda elektricitet, strömmar elektronen från den negativa till den positiva polen. När det är en blank kontroll är elektronflödet jämnt, därför registreras ingen impedans. När cellerna sås, och när fler och fler celler fäster på botten av brunnen, är impedansen i elektronflödet närvarande och registreras av datorn. Med hjälp av detta impedansvärde omvandlar instrumentet det till ett CI-värde, vilket indikerar antalet celler som är fästa vid brunnens botten (vidhäftning). Skapad med BioRender. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytocidal virusinfektion i tillåtande celler är vanligtvis förknippad med betydande förändringar i cellmorfologi och biosyntes36. De virusinducerade cellulära morfologiska förändringarna, såsom cellkrympning, cellförstoring och/eller syncytibildning, är också kända som cytopatiska effekter (CPE), som är karakteristiska för vissa virusinfektioner37. I EC beskrevs CPE som förstörelse av celler och nedbrytning av de täta korsningarna mellan varje EC, vilket orsakade nedbrytningen av endotelbarriären38,39. CPE i HUVECs kan beskrivas som att cellerna i ett lager lossnar och flyter från vävnadsodlingskärlet. De infekterade cellernas morfologiska förändringar, såsom avlossning och flytning av vidhäftande celler, kan kontinuerligt detekteras med hjälp av RTCA-metoden. Denna teknik är baserad på elektrisk impedans, vilket gör det möjligt att övervaka celler i realtid upp till några sekunder. Det möjliggör kvantifiering av cellproliferation, morfologiska förändringar, och när det gäller HUVEC, kan det användas för att övervaka förändringar i endotelintegritet och cellbarriärfunktion40 vid stimulering.
I denna studie är det kritiska steget uppställningen av experimentet, där 96-brunnars motståndsplattan används. Detta för att säkerställa att alla anslutningar på analysatorn är väl anslutna till plattan. I RTCA omvandlas det uppmätta impedansvärdet som ett CI-värde för att differentiera skillnaderna i cellantal, vidhäftningsgrad, cellulär morfologi och cellviabilitet41. Minskningen av den registrerade impedansen av RTCA-analysatorn, vilket översätts till en minskning av CI-värdet, tyder på ett minskat cellantal, svagare vidhäftningsgrad och betydande förändringar i cellulär morfologi42. Därför är det också viktigt att testa cellinjernas lämplighet och optimala cellantal som ska användas i RTCA-experimentet. Det är viktigt att avgöra om det önskade CI-indexet kan uppnås innan testning utförs på cellerna med hjälp av RTCA-systemet. Dessutom hjälper detta också till att avgöra om RTCA-systemet är lämpligt för att övervaka celltillväxt och celldödsprofiler för utvalda celltyper. I vår studie observerades en kraftig minskning av CI-värdena när HUVECs infekterades med ZIKV P6-740 vid MOI på 0,1 och 1. Den branta nedgången i CI-värdet, vilket tyder på att HUVEC cellulära morfologiska förändringar inträffade efter infektion, och detta ledde till störningar av snäva korsningar och EC-vaskulär integritet.
Konventionellt uppskattas CPE som orsakas av virusinfektion i celler in vitro baserat på mikroskopisk observation av de infekterade cellerna. Dessutom tillåter vissa andra analyser, såsom plackanalysen, visualisering av CPE:er (såsom cellavlossning) och används för att mäta omfattningen av CPE:erna42. Dessa metoder har dock begränsningar genom att de endast ger information om diskreta tidpunkter för de cellulära morfologiska förändringarna (endpoint assays). Andra analyser, såsom immunofluorescensfärgning, förlitar sig på kombinationer av specifika antikroppar märkta med en fluorofor för att visualisera de morfologiska förändringarna43. Även om immunofluorescensanalysen har en bred kapacitet som möjliggör visualisering av många komponenter i en given vävnads- eller celltyp, tillåter denna teknik inte övervakning och detektion i realtid under virusinfektion. Däremot registrerar RTCA-systemet cellmorfologiska förändringar i realtid under virusinfektionen, vilket gör det möjligt att fånga upp övergående effekter, såsom övergående vaskulärt läckage, som kan missas av endpoint-analyser. Till exempel skulle endpoint-analyser misslyckas med att upptäcka data och morfologiska förändringar så tidigt som 60 HPI, 80 HPI och 100 HPI. Förutom RTCA är mätning av transepitelial elektrisk resistans (TEER) en annan vanlig metod för att övervaka cell-till-cell-interaktioner, där det elektriska motståndet över cellmonolagret mäts. TEER kräver dock flera upprepade mätningar över tid för att övervaka levande cellaktiviteter och utförs ofta på ett mindre antal prover eller brunnar åt gången. Som ett resultat har TEER vanligtvis lägre genomströmning jämfört med RTCA, som kan köra upp till 96 brunnar samtidigt44.
Trots sina fördelar har RTCA-systemet flera begränsningar. Den största begränsningen för RTCA-systemet är den dyra utrustningen och förbrukningsvarorna. De specialiserade guld-mikroelektrodplattorna som används av RTCA-systemet är relativt dyra, för engångsbruk och engångs45. Dessutom kan de cellmorfologiska förändringarna inte avbildas och fångas på en inspelare (kamera), och analysen kan inte heller fånga ackumuleringen av virusantigenet eller förändringar i cellyteproteinet, såsom VE-cadherin i HUVECs46. Som ett resultat av detta kan RTCA inte visualisera de cellmorfologiska förändringar som skulle ge ytterligare användbar information för att belysa sjukdomspatogenesen. Under analysen eller modellfastställandet skulle ytterligare färgningsverifiering, t.ex. VE-cadherinfärgning för HUVEC, vara användbar för att validera de erhållna mätningarna. Dessutom är RTCA-systemet begränsat till vidhäftande cellinjer, eftersom det kräver att celler fästs i botten av brunnarna för att impedansen ska registreras. Därför kan den rapporterade analysen inte användas för icke-vidhäftande cellinjer46.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett cellanalysprotokoll i realtid med hjälp av RTCA-instrumentet för att övervaka förändringar i endotelceller vid ZIKV-infektion i 96-brunnsformat. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella slutpunktsanalyser, eftersom den möjliggör ett icke-invasivt och icke-etikettintensivt tillvägagångssätt för kontinuerlig övervakning av cellulära morfologiska förändringar i realtid. Denna analys kan också användas för att analysera vaskulära integritetsförändringar hos andra cellinjer i olika experimentella uppställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några motstridiga intressen.
Acknowledgments
Denna forskning fick stöd från Malaysias ministerium för högre utbildning inom ramen för programmet Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) och finansiering inom ramen för Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) | Sciencell | 0503 | |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| Collagen Type 1 | SIgma-Aldrich | C3867 | |
| Endothelial cell growth supplement (ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| E-plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232368001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| Hemocytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Sciencell | 8000 | |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 Laptop | Dell | - | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Reagent reservior | Tarsons | T38-524090 | |
| RTCA resistor plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232350001 | |
| RTCA Software Pro (Version 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | 5454433001 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
References
- Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
- Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
- Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
- Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
- Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
- Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
- Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
- Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
- Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
- Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
- Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
- Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
- Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
- Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
- Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
- Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
- Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
- Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
- Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
- Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
- Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
- Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
- Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
- Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
- Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
- Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
- Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S.
- Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
- Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
- Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A.
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
- Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
- Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
- Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
- Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).
