Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili
Summary
Descriviamo protocolli graduali che misurano la respirazione mitocondriale di neutrofili di topo e umani e cellule HL60 utilizzando l’analizzatore di flusso extracellulare metabolico.
Abstract
I neutrofili sono la prima linea di difesa e i leucociti più abbondanti nell’uomo. Queste cellule effettrici svolgono funzioni come la fagocitosi e l’esplosione ossidativa e creano trappole extracellulari di neutrofili (NET) per la clearance microbica. Nuove conoscenze sulle attività metaboliche dei neutrofili sfidano il concetto iniziale che si basano principalmente sulla glicolisi. La misurazione precisa delle attività metaboliche può dispiegare diversi requisiti metabolici dei neutrofili, tra cui il ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) (noto anche come ciclo di Krebs), la fosforilazione ossidativa (OXPHOS), la via del pentoso fosfato (PPP) e l’ossidazione degli acidi grassi (FAO) in condizioni fisiologiche e in stati patologici. Questo articolo descrive un protocollo passo-passo e i prerequisiti per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale sui neutrofili derivati dal midollo osseo di topo, sui neutrofili derivati dal sangue umano e sulla linea cellulare HL60 simile ai neutrofili, utilizzando l’analisi del flusso metabolico su un analizzatore di flusso extracellulare metabolico. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare le funzioni mitocondriali dei neutrofili in condizioni normali e di malattia.
Introduction
I mitocondri svolgono un ruolo importante nella bioenergetica cellulare, che genera adenosina trifosfato (ATP) mediante fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Oltre a questo, il ruolo dei mitocondri si estende alla generazione e alla disintossicazione delle specie reattive dell’ossigeno, alla regolazione del calcio della matrice citoplasmatica e mitocondriale, alla sintesi cellulare, al catabolismo e al trasporto di metaboliti all’interno della cellula1. La respirazione mitocondriale è essenziale in tutte le cellule, poiché la loro disfunzione può causare problemi metabolici 2, comprese le malattie cardiovascolari3 e un’ampia varietà di malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all’età4, il morbo di Parkinson e l’Alzheimer5 e la malattia di Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.
Studi al microscopio elettronico sui neutrofili hanno rivelato che ci sono relativamente pochi mitocondri7 e fanno molto affidamento sulla glicolisi per la loro produzione di energia poiché i tassi di respirazione mitocondriale sono molto bassi8. Tuttavia, i mitocondri sono cruciali per le funzioni dei neutrofili, come la chemiotassi9 e l’apoptosi10,11,12. Uno studio precedente ha rivelato una complessa rete mitocondriale nei neutrofili umani con alto potenziale di membrana. La perdita di potenziale della membrana mitocondriale è un indicatore precoce dell’apoptosi dei neutrofili10. Il trattamento con disaccoppiatore mitocondriale cianuro di carbonile m-clorofenil idrazono (CCCP) ha mostrato una significativa inibizione della chemiotassi, insieme a un cambiamento nella morfologia mitocondriale 9,10.
Sebbene la fonte primaria di energia per i neutrofili sia la glicolisi, i mitocondri forniscono l’ATP che avvia l’attivazione dei neutrofili alimentando la prima fase della segnalazione purinergica, che aumenta la segnalazione Ca2+, amplifica la produzione di ATP mitocondriale e avvia le risposte funzionali dei neutrofili13. La disfunzione della catena respiratoria mitocondriale provoca un’eccessiva produzione di specie tossiche reattive dell’ossigeno (ROS) e porta a danni patogeni14,15,16. La NETosi, che è il processo di formazione di trappole extracellulari di neutrofili (NET), è una proprietà critica dei neutrofili che li aiuta a combattere contro i patogeni17 e contribuisce a molte condizioni patologiche, tra cui cancro, trombosi e disturbi autoimmuni18. I ROS di derivazione mitocondriale contribuiscono alla NETosi19, il DNA mitocondriale può essere un componente di NETs18 e l’omeostasi mitocondriale alterata compromette NETosis 20,21,22,23,24. Inoltre, durante la normale differenziazione o maturazione, la riprogrammazione metabolica dei neutrofili viene invertita limitando l’attività glicolitica, e si impegnano nella respirazione mitocondriale e mobilitano i lipidi intracellulari25,26.
L’analizzatore del flusso metabolico extracellulare può monitorare e quantificare continuamente la respirazione mitocondriale e la glicolisi delle cellule vive. L’analizzatore utilizza una cartuccia sensore a 96 pozzetti e due fluorofori per quantificare la concentrazione di ossigeno (O2) e le variazioni di pH. La cartuccia del sensore si trova sopra il monostrato cellulare durante il test e forma una microcamera alta ~ 200 nm. I fasci di fibre ottiche nell’analizzatore vengono utilizzati per eccitare i fluorofori e rilevare le variazioni di intensità fluorescente. Le variazioni in tempo reale della concentrazione di O2 e del pH vengono calcolate automaticamente e mostrate come tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR). Ci sono quattro porte sulla cartuccia del sensore che consentono di caricare fino a quattro composti in ciascun pozzetto durante le misurazioni del test. Questo protocollo si concentra sulla quantificazione della respirazione mitocondriale dei neutrofili di topo e umani, nonché delle cellule HL60 simili ai neutrofili, utilizzando l’analizzatore del flusso extracellulare metabolico.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura standard che misura la respirazione mitocondriale dei neutrofili utilizzando l’analizzatore del flusso extracellulare metabolico è limitata da molti fattori, tra cui il numero di cellule, la crescita cellulare e la vitalità. Ogni concentrazione di composto varia tra il tipo e la fonte di cellule in questo test. Oligomicina e rotenone / antimicina A sono per lo più utilizzati in una concentrazione simile tra la maggior parte dei tipi di cellule. Tuttavia, poiché la frequenza respiratoria massima indotta …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il Dr. Anthony T. Vella e la Dr. Federica Aglianoin del Dipartimento di Immunologia di UConn Health per la loro formazione nell’uso dell’analizzatore di flusso extracellulare metabolico e la Dr. Lynn Puddington del Dipartimento di Immunologia di UConn Health per il suo supporto agli strumenti. Riconosciamo la dottoressa Geneva Hargis della UConn School of Medicine per il suo aiuto nella scrittura scientifica e nella revisione di questo manoscritto. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 e P20GM139763), un fondo di avvio di UConn Health e una borsa di rientro professionale dell’American Association of Immunologists.
Materials
| 37 °C non-CO2 incubator | Precision | Economy Model 2EG | Instrument |
| Biorender | Software Application | ||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
| Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 102416-100 | Reagent |
| EasySep Magnet | STEMCELL | 18000 | Magnet |
| EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit | STEMCELL | 19762A | Reagents |
| Graphpad Prism 9 | Software Application | ||
| Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
| Ketamine (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | Anesthetic |
| PBS | Cytiva | SH30256.01 | Reagents |
| Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | polysaccharide solution |
| Purified mouse anti-human CD18 antibody | Biolegend | 302102 | Clone TS1/18 |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11-875-093 | Reagents |
| Seahorse metabolic extracellular flux analyzer | Agilent | XFe96 | Instrument |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | mitochondrial stress test Kit |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
| Vactrap 2 Vacum Trap | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | Instrument |
| Wave | Software Application | ||
| XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent | 103577-100 | Reagent |
| XF 100 mM Pyruvate Solution | Agilent | 103578-100 | Reagent |
| XF 200 mM Glutamine Solution | Agilent | 103579-100 | Reagent |
| XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | Reagent |
| XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Material |
| Xylazine (AnaSed Injection) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | Anesthetic |
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