JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologia e infezioni

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Abstract

Los neutrófilos son la primera línea de defensa y los leucocitos más abundantes en los humanos. Estas células efectoras realizan funciones como la fagocitosis y el estallido oxidativo, y crean trampas extracelulares de neutrófilos (NET) para la eliminación microbiana. Nuevos conocimientos sobre las actividades metabólicas de los neutrófilos desafían el concepto inicial de que se basan principalmente en la glucólisis. La medición precisa de las actividades metabólicas puede desplegar diferentes requisitos metabólicos de los neutrófilos, incluido el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) (también conocido como ciclo de Krebs), la fosforilación oxidativa (OXPHOS), la vía de la pentosa fosfato (PPP) y la oxidación de ácidos grasos (FAO) en condiciones fisiológicas y en estados de enfermedad. Este documento describe un protocolo paso a paso y requisitos previos para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como un indicador de la respiración mitocondrial en neutrófilos derivados de la médula ósea del ratón, neutrófilos derivados de la sangre humana y la línea celular HL60 similar a los neutrófilos, utilizando el análisis de flujo metabólico en un analizador de flujo extracelular metabólico. Este método se puede utilizar para cuantificar las funciones mitocondriales de los neutrófilos en condiciones normales y de enfermedad.

Introduction

Las mitocondrias juegan un papel importante en la bioenergética celular, que genera trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilación oxidativa (OXPHOS). Además de esto, el papel de las mitocondrias se extiende a la generación y desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, la regulación del calcio de la matriz citoplasmática y mitocondrial, la síntesis celular, el catabolismo y el transporte de metabolitos dentro de la célula1. La respiración mitocondrial es esencial en todas las células, ya que su disfunción puede dar lugar a problemas metabólicos 2, incluyendo enfermedades cardiovasculares3 y una amplia variedad de enfermedades neurodegenerativas, como la degeneración macular relacionada con la edad4, las enfermedades de Parkinson y Alzheimer5, y la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.

Los estudios microscópicos electrónicos sobre neutrófilos revelaron que hay relativamente pocas mitocondrias7, y dependen en gran medida de la glucólisis para su producción de energía, ya que las tasas de respiración mitocondrial son muy bajas8. Sin embargo, las mitocondrias son cruciales para las funciones de los neutrófilos, como la quimiotaxis9 y la apoptosis10,11,12. Un estudio previo reveló una compleja red mitocondrial en neutrófilos humanos con alto potencial de membrana. La pérdida de potencial de la membrana mitocondrial es un indicador temprano de apoptosis de neutrófilos10. El tratamiento con cianuro de carbonilo mitocondrial con cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona (CCCP) mostró inhibición significativa en la quimiotaxis, junto con un cambio en la morfología mitocondrial 9,10.

Aunque la principal fuente de energía para los neutrófilos es la glucólisis, las mitocondrias proporcionan el ATP que inicia la activación de los neutrófilos al alimentar la primera fase de la señalización purinérgica, lo que aumenta la señalización de Ca2+, amplifica la producción de ATP mitocondrial e inicia las respuestas funcionales de los neutrófilos13. La disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial resulta en una producción excesiva de especies tóxicas reactivas de oxígeno (ROS) y conduce a daños patógenos14,15,16. La NETosis, que es el proceso de formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE), es una propiedad crítica de los neutrófilos que les ayuda a luchar contra los patógenos17 y contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo cáncer, trombosis y trastornos autoinmunes18. Las ROS derivadas de mitocondrial contribuyen a NETosis19, el ADN mitocondrial puede ser un componente de NETs18, y la homeostasis mitocondrial alterada afecta NETosis 20,21,22,23,24. Además, durante la diferenciación o maduración normal, la reprogramación metabólica de los neutrófilos se invierte al limitar la actividad glucolítica, y participan en la respiración mitocondrial y movilizan los lípidos intracelulares25,26.

El analizador de flujo extracelular metabólico puede monitorear y cuantificar continuamente la respiración mitocondrial de células vivas y la glucólisis. El analizador utiliza un cartucho sensor de formato placa de 96 pocillos y dos fluoróforos para cuantificar la concentración de oxígeno (O2) y los cambios de pH. El cartucho sensor está por encima de la monocapa celular durante el ensayo y forma una microcámara de ~200 nm de altura. Los haces de fibra óptica en el analizador se utilizan para excitar los fluoróforos y detectar los cambios de intensidad fluorescente. Los cambios en tiempo real en la concentración deO2 y el pH se calculan automáticamente y se muestran como tasa de consumo de oxígeno (OCR) y tasa de acidificación extracelular (ECAR). Hay cuatro puertos en el cartucho del sensor que permiten cargar hasta cuatro compuestos en cada pocillo durante las mediciones del ensayo. Este protocolo se centra en cuantificar la respiración mitocondrial de neutrófilos humanos y de ratón, así como las células HL60 similares a los neutrófilos, utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Protocol

Las muestras de sangre total heparinizadas se obtuvieron de donantes humanos sanos después de obtener el consentimiento informado, según lo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UConn Health de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los experimentos con animales siguieron las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UConn Health (IACUC), y la aprobación para el uso de roedores se obtuvo del IACUC de UConn Health de acuerdo con los criterios descritos en la Guía para el Cu…

Representative Results

Se muestra una dinámica representativa de OCR que indica los cambios en la respiración mitocondrial en respuesta a la mezcla de oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A de neutrófilos de ratón (Figura 3A), neutrófilos humanos (Figura 3B) y células HL60 indiferenciadas y diferenciadas (Figura 3C). En todas las células, el tratamiento con oligomicina disminuye el valor de OCR al inhibir el canal de protones de la ATP sintasa; …

Discussion

El procedimiento estándar que mide la respiración mitocondrial de los neutrófilos utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico está limitado por muchos factores, incluido el número de células, el crecimiento celular y la viabilidad. Cada concentración de compuesto varía entre el tipo y la fuente de células en este ensayo. La oligomicina y la rotenona/antimicina A se utilizan principalmente en una concentración similar entre la mayoría de los tipos de células. Sin embargo, como la frecuencia res…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Anthony T. Vella y a la Dra. Federica Aglianoin del Departamento de Inmunología de UConn Health por su capacitación en el uso del analizador de flujo extracelular metabólico, y a la Dra. Lynn Puddington en el Departamento de Inmunología de UConn Health por su apoyo a los instrumentos. Agradecemos a la Dra. Geneva Hargis de la Facultad de Medicina de UConn por su ayuda con la redacción científica y la edición de este manuscrito. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (R01HL145454), el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (R35GM147713 y P20GM139763), un fondo inicial de UConn Health y una beca de reingreso profesional de la Asociación Americana de Inmunólogos.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
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