JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunologia e infezioni

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。

Abstract

好中球は防御の最前線であり、ヒトで最も豊富な白血球です。これらのエフェクター細胞は、食作用や酸化バーストなどの機能を果たし、微生物クリアランスのための好中球細胞外トラップ(NET)を作成します。好中球の代謝活動に関する新しい洞察は、好中球が主に解糖に依存しているという初期の概念に挑戦します。代謝活性の正確な測定は、トリカルボン酸(TCA)サイクル(クレブス回路としても知られています)、酸化的リン酸化(OXPHOS)、ペントースリン酸経路(PPP)、および生理学的条件および疾患状態における脂肪酸酸化(FAO)を含む好中球のさまざまな代謝要件を明らかにすることができます。本論文では、代謝細胞外フラックス分析装置による代謝フラックス解析を用いて、マウス骨髄由来好中球、ヒト血液由来好中球、好中球様HL60細胞株のミトコンドリア呼吸の指標として酸素消費率(OCR)を測定するための段階的なプロトコルと前提条件について説明します。この方法は、正常および疾患条件下での好中球のミトコンドリア機能を定量するために使用できます。

Introduction

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化(OXPHOS)によってアデノシン三リン酸(ATP)を生成する細胞の生体エネルギー学において主要な役割を果たしています。これに加えて、ミトコンドリアの役割は、活性酸素種の生成と解毒、細胞質およびミトコンドリアマトリックスカルシウム調節、細胞合成、異化、および細胞内の代謝産物の輸送にまで及びます1。ミトコンドリア呼吸は、その機能不全が心血管疾患3や加齢黄斑変性症4、パーキンソン病およびアルツハイマー病5、シャルコー・マリー・トゥース病2A(CMT2A)6などの多種多様な神経変性疾患を含む代謝障害2を引き起こす可能性があるため、すべての細胞に不可欠です。

好中球に関する電子顕微鏡的研究により、ミトコンドリアは比較的少なく7、ミトコンドリアの呼吸速度は非常に低いため、エネルギー産生を解糖に大きく依存していることが明らかになりました8。ただし、ミトコンドリアは、走化性9やアポトーシス10、11、12などの好中球機能にとって重要です。以前の研究では、膜電位の高いヒト好中球における複雑なミトコンドリアネットワークが明らかになりました。ミトコンドリア膜電位損失は、好中球アポトーシスの早期指標である10。ミトコンドリア脱共役カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)による処理は、ミトコンドリアの形態の変化とともに、走化性の有意な阻害を示しました9,10。

好中球の主要なエネルギー源は解糖系であるが、ミトコンドリアは、プリン作動性シグナル伝達の第1段階に燃料を供給することによって好中球活性化を開始するATPを提供し、これはCa2+シグナル伝達を高め、ミトコンドリアATP産生を増幅し、好中球機能応答を開始する13。ミトコンドリア呼吸鎖の機能不全は、有毒な活性酸素種(ROS)の過剰産生をもたらし、病原性損傷につながります14,15,16。好中球細胞外トラップ(NET)を形成するプロセスであるNETosisは、好中球の重要な特性であり、病原体と戦うのに役立ち17、癌、血栓症、自己免疫疾患などの多くの病理学的状態に寄与します18。ミトコンドリア由来のROSはNETosis19に寄与し、ミトコンドリアDNAはNETs18の構成要素となり得、そして変化したミトコンドリア恒常性はNETosis20,21,22,23,24を損なう。さらに、正常な分化または成熟の間に、好中球代謝リプログラミングは解糖活性を制限することによって逆転し、それらはミトコンドリア呼吸に従事し、細胞内脂質を動員します25,26。

代謝細胞外フラックス分析装置は、生細胞のミトコンドリア呼吸と解糖を継続的に監視および定量することができます。この分析装置は、96ウェルプレートフォーマットのセンサーカートリッジと2つの蛍光色素を使用して、酸素(O2)濃度とpH変化を定量します。センサーカートリッジは、アッセイ中に細胞単層の上にあり、~200 nmの高さのマイクロチャンバーを形成します。分析器内の光ファイバー束は、蛍光色素を励起し、蛍光強度の変化を検出するために使用されます。O2 濃度とpHのリアルタイム変化が自動的に計算され、酸素消費速度(OCR)と細胞外酸性化速度(ECAR)として表示されます。センサーカートリッジには4つのポートがあり、アッセイ測定中に各ウェルに最大4つの化合物をロードできます。このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、ならびに好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。

Protocol

ヘパリン処理全血サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってUConn Healthの治験審査委員会によって承認されたように、インフォームドコンセントを取得した後、健康なヒトドナーから取得されました。すべての動物実験は、UConn Health施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従い、げっ歯類の使用の承認は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている基準…

Representative Results

マウス好中球(図3A)、ヒト好中球(図3B)、および未分化および分化したHL60細胞(図3C)の混合物であるオリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/抗マイシンA混合物に応答するミトコンドリア呼吸の変化を示す代表的なOCRダイナミクスが示されています。すべての細胞において、オリゴマイシン処理は、ATPシンターゼのプロトンチャネ…

Discussion

代謝細胞外フラックス分析装置を使用して好中球のミトコンドリア呼吸を測定する標準的な手順は、細胞数、細胞増殖、生存率などの多くの要因によって制限されます。各化合物濃度は、このアッセイにおける細胞の種類と供給源によって異なります。オリゴマイシンとロテノン/抗マイシンAは、ほとんどの細胞タイプの中で主に同様の濃度で使用されます。ただし、FCCPによって誘発される?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UConn Healthの免疫学部のAnthony T. Vella博士とFederica Aglianoin博士の代謝細胞外フラックス分析装置の使用に関するトレーニング、およびUConn Healthの免疫学部のLynn Puddington博士の機器のサポートに感謝します。UConn医学部のジュネーブ・ハーギス博士が、この原稿の科学的執筆と編集に協力してくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所、国立心臓肺血液研究所(R01HL145454)、国立総合医学研究所(R35GM147713およびP20GM139763)、UConn Healthのスタートアップファンド、および米国免疫学会のキャリア再エントリーフェローシップからの助成金によってサポートされました。

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
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