Descriviamo protocolli graduali che misurano la respirazione mitocondriale di neutrofili di topo e umani e cellule HL60 utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare metabolico.
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Articolo metodologico
Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili
In questo articolo
Sommario
Abstract
I neutrofili sono la prima linea di difesa e i leucociti più abbondanti nell'uomo. Queste cellule effettrici svolgono funzioni come la fagocitosi e l'esplosione ossidativa e creano trappole extracellulari di neutrofili (NET) per la clearance microbica. Nuove conoscenze sulle attività metaboliche dei neutrofili sfidano il concetto iniziale che si basano principalmente sulla glicolisi. La misurazione precisa delle attività metaboliche può dispiegare diversi requisiti metabolici dei neutrofili, tra cui il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) (noto anche come ciclo di Krebs), la fosforilazione ossidativa (OXPHOS), la via del pentoso fosfato (PPP) e l'ossidazione degli acidi grassi (FAO) in condizioni fisiologiche e in stati patologici. Questo articolo descrive un protocollo passo-passo e i prerequisiti per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale sui neutrofili derivati dal midollo osseo di topo, sui neutrofili derivati dal sangue umano e sulla linea cellulare HL60 simile ai neutrofili, utilizzando l'analisi del flusso metabolico su un analizzatore di flusso extracellulare metabolico. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare le funzioni mitocondriali dei neutrofili in condizioni normali e di malattia.
Introduzione
I mitocondri svolgono un ruolo importante nella bioenergetica cellulare, che genera adenosina trifosfato (ATP) mediante fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Oltre a questo, il ruolo dei mitocondri si estende alla generazione e alla disintossicazione delle specie reattive dell'ossigeno, alla regolazione del calcio della matrice citoplasmatica e mitocondriale, alla sintesi cellulare, al catabolismo e al trasporto di metaboliti all'interno della cellula1. La respirazione mitocondriale è essenziale in tutte le cellule, poiché la loro disfunzione può causare problemi metabolici 2, comprese le malattie cardiovascolari3 e un'amp....
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Protocollo
I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti da donatori umani sani dopo aver ottenuto il consenso informato, come approvato dall'Institutional Review Board di UConn Health in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti gli esperimenti sugli animali hanno seguito le linee guida dell'UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e l'approvazione per l'uso dei roditori è stata ottenuta dall'UConn Health IACUC secondo i criteri delineati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6 a 6 settimane di età.
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Risultati
Le dinamiche OCR rappresentative sono mostrate indicando i cambiamenti della respirazione mitocondriale in risposta a oligomicina, FCCP e rotenone / antimicina Una miscela di neutrofili di topo (Figura 3A), neutrofili umani (Figura 3B) e cellule HL60 indifferenziate e differenziate (Figura 3C). In tutte le cellule, il trattamento con oligomicina diminuisce il valore OCR inibendo il canale protonico dell'ATP sintasi; Il trattamento F.......
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Discussione
La procedura standard che misura la respirazione mitocondriale dei neutrofili utilizzando l'analizzatore del flusso extracellulare metabolico è limitata da molti fattori, tra cui il numero di cellule, la crescita cellulare e la vitalità. Ogni concentrazione di composto varia tra il tipo e la fonte di cellule in questo test. Oligomicina e rotenone / antimicina A sono per lo più utilizzati in una concentrazione simile tra la maggior parte dei tipi di cellule. Tuttavia, poiché la frequenza respiratoria massima indotta da FC.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Riconosciamo il Dr. Anthony T. Vella e la Dr. Federica Aglianoin del Dipartimento di Immunologia di UConn Health per la loro formazione nell'uso dell'analizzatore di flusso extracellulare metabolico e la Dr. Lynn Puddington del Dipartimento di Immunologia di UConn Health per il suo supporto agli strumenti. Riconosciamo la dottoressa Geneva Hargis della UConn School of Medicine per il suo aiuto nella scrittura scientifica e nella revisione di questo manoscritto. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 e P20GM13....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 37 gradi C non CO2 incubatore | Economia | di precisione Modello 2EG | Strumento |
| Biorender | Applicazione software | ||
| Centrifuga | Eppendorf | Modello 5810R | |
| Strumento Corning Adesivo per cellule e tessuti Cell-Tak | Corning | 102416-100 | Reagente |
| Magnete EasySep | Magnete STEMCELL | 18000 | Kit |
| di arricchimento dei neutrofili EasySepMouse | STEMCELL | 19762A | Reagenti |
| Graphpad Prism 9 | Applicazione software | ||
| Soluzione di albumina sierica umana (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagenti |
| Ketamina (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | Anestetico |
| PBS | Cytiva | SH30256.01 | Reagenti |
| Secchi per piastre | Eppendorf | UL155 | Accessorio |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (1114683 precedente) | soluzione polisaccaridica |
| Anticorpo CD18 anti-umano di topo purificato | Biolegend | 302102 | Clone TS1/18 |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11-875-093 | Reagenti |
| Cavalluccio Marino Analizzatore di flusso extracellulare metabolico | Agilent | XFe96 | Strumento |
| Cavalluccio Marino XF Kit per test da sforzo Mito Cell | Agilent | 103015-100 | Kit per test da sforzo mitocondriale |
| Rotore a secchiello | oscillante Eppendorf | A-4-62 | Rotore |
| Vactrap 2 Vacum Trap | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | Instrument |
| Wave Software | Application | ||
| XF 1.0 M Soluzione di glucosio | Agilent | 103577-100 | Reagente |
| XF 100 mM Soluzione di piruvato | Agilent | 103578-100 | Reagente |
| XF 200 mM Soluzione di glutammina | Agilent | 103579-100 | Reagente |
| XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | Reagente |
| XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Materiale |
| Xilazina (iniezione AnaSed) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | Anestetico |
Riferimenti
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
- Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation....
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Ristampe e permessi
