JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Immunologia e infezioni

Sanntidsmåling av den mitokondrielle bioenergetiske profilen til nøytrofiler

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Vi beskriver trinnvise protokoller som måler mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler og HL60-celler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator.

Abstract

Neutrofiler er den første forsvarslinjen og de rikeste leukocytter hos mennesker. Disse effektorcellene utfører funksjoner som fagocytose og oksidativt utbrudd, og skaper nøytrofile ekstracellulære feller (NET) for mikrobiell clearance. Ny innsikt i nøytrofilenes metabolske aktiviteter utfordrer det tidlige konseptet om at de primært er avhengige av glykolyse. Nøyaktig måling av metabolske aktiviteter kan utfolde forskjellige metabolske krav til nøytrofiler, inkludert trikarboksylsyre (TCA) -syklusen (også kjent som Krebs-syklusen), oksidativ fosforylering (OXPHOS), pentosefosfatvei (PPP) og fettsyreoksidasjon (FAO) under fysiologiske forhold og sykdomstilstander. Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll og forutsetninger for å måle oksygenforbrukshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell respirasjon på nøytrofiler fra benmarg fra mus, humane blodavledede nøytrofiler og den nøytrofillignende HL60-cellelinjen, ved bruk av metabolsk fluksanalyse på en metabolsk ekstracellulær fluksanalysator. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere mitokondrielle funksjoner av nøytrofiler under normale og sykdomsforhold.

Introduction

Mitokondrier spiller en viktig rolle i cellebioenergetikk, som genererer adenosintrifosfat (ATP) ved oksidativ fosforylering (OXPHOS). I tillegg til dette strekker mitokondriens rolle seg inn i generering og avgiftning av reaktive oksygenarter, cytoplasmatisk og mitokondriell matrikskalsiumregulering, cellulær syntese, katabolisme og transport av metabolitter i cellen1. Mitokondriell respirasjon er viktig i alle celler, da deres dysfunksjon kan resultere i metabolske problemer 2, inkludert kardiovaskulære sykdommer3 og et bredt spekter av nevrodegenerative sykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon4, Parkinsons og Alzheimers sykdommer5 og Charcot-Marie-Tooth sykdom2 A (CMT2A) 6.

Elektronmikroskopiske studier på nøytrofiler viste at det er relativt få mitokondrier7, og de er avhengige av glykolyse for energiproduksjonen, da mitokondriell respirasjonsfrekvens er svært lav8. Imidlertid er mitokondrier avgjørende for nøytrofile funksjoner, som kjemotaksis9 og apoptose10,11,12. En tidligere studie avslørte et komplekst mitokondrielt nettverk i humane nøytrofiler med høyt membranpotensial. Mitokondriemembranens potensielle tap er en tidlig indikator på nøytrofil apoptose10. Behandling med mitokondriell utkobling av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) viste signifikant hemming i kjemotaksis, sammen med endring i mitokondriell morfologi 9,10.

Selv om den primære energikilden for nøytrofiler er glykolyse, gir mitokondrier ATP som initierer nøytrofil aktivering ved å brenne den første fasen av purinerg signalering, noe som øker Ca2 + -signalering, forsterker mitokondriell ATP-produksjon og initierer nøytrofile funksjonelle responser13. Dysfunksjon av mitokondrie-respirasjonskjeden resulterer i overdreven produksjon av giftige reaktive oksygenarter (ROS) og fører til patogene skader14,15,16. NETosis, som er prosessen med å danne nøytrofile ekstracellulære feller (NET), er en kritisk egenskap hos nøytrofiler som hjelper dem med å bekjempe patogener17 og bidrar til mange patologiske forhold, inkludert kreft, trombose og autoimmune lidelser18. Mitokondrie-avledet ROS bidrar til NETosis19, mitokondrielt DNA kan være en komponent i NET18, og endret mitokondriell homeostase svekker NETosis 20,21,22,23,24. Videre, under normal differensiering eller modning, blir nøytrofil metabolsk omprogrammering reversert ved å begrense glykolytisk aktivitet, og de engasjerer seg i mitokondriell respirasjon og mobiliserer intracellulære lipider25,26.

Den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren kan kontinuerlig overvåke og kvantifisere levende celle mitokondriell respirasjon og glykolyse. Analysatoren benytter en 96-brønns plateformat sensorpatron og to fluoroforer for å kvantifisere oksygenkonsentrasjon (O2) og pH-endringer. Sensorpatronen er over cellemonolaget under analysen og danner et ~ 200 nm høyt mikrokammer. De optiske fiberbuntene i analysatoren brukes til å opphisse fluoroforene og oppdage fluorescerende intensitetsendringer. Sanntidsendringer iO2-konsentrasjon og pH beregnes automatisk og vises som oksygenforbrukshastighet (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR). Det er fire porter på sensorkassetten som tillater lasting av opptil fire forbindelser i hver brønn under analysemålingene. Denne protokollen fokuserer på å kvantifisere mitokondriell respirasjon av mus og humane nøytrofiler, samt de nøytrofillignende HL60-cellene, ved hjelp av den metabolske ekstracellulære fluksanalysatoren.

Protocol

Hepariniserte fullblodsprøver ble innhentet fra friske humane donorer etter å ha innhentet informert samtykke, som godkjent av Institutional Review Board of UConn Health i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Alle dyreforsøk fulgte UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer, og godkjenning for bruk av gnagere ble innhentet fra UConn Health IACUC i henhold til kriterier som er skissert i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health. Hannmus C57BL/6 …

Representative Results

Representativ OCR-dynamikk er vist som indikerer mitokondrielle respirasjonsendringer som respons på oligomycin, FCCP og rotenon/antimycin A-blanding av nøytrofile museceller (figur 3A), humane nøytrofile granulocytter (figur 3B) og udifferensierte og differensierte HL60-celler (figur 3C). I alle celler reduserer oligomycinbehandling OCR-verdien ved å hemme protonkanalen til ATP-syntase; FCCP-behandling gjenoppretter OCR-verdien…

Discussion

Standardprosedyren som måler mitokondriell respirasjon av nøytrofiler ved hjelp av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator er begrenset av mange faktorer, inkludert celleantall, cellevekst og levedyktighet. Hver sammensatt konsentrasjon varierer mellom type og kilde til celler i denne analysen. Oligomycin og rotenon/antimycin A brukes mest i en lignende konsentrasjon blant de fleste celletyper. Siden FCCP-indusert maksimal respirasjonsfrekvens varierer mellom forskjellige celler, er det imidlertid nødvendig med for…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkjenner Dr. Anthony T. Vella og Dr. Federica Aglianoin fra Institutt for immunologi ved UConn Health for deres opplæring i bruk av metabolsk ekstracellulær fluksanalysator, og Dr. Lynn Puddington i Institutt for immunologi ved UConn Health for hennes støtte til instrumentene. Vi anerkjenner Dr. Geneva Hargis fra UConn School of Medicine for hennes hjelp med vitenskapelig skriving og redigering av dette manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 og P20GM139763), et oppstartsfond fra UConn Health og et karrierestipend fra American Association of Immunologs.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Keywords: Mitochondrial RespirationNeutrophilsHL60 CellsMetabolic Extracellular Flux AnalyzerMitochondrial FunctionCell Seeding DensityAssay MediumMouse NeutrophilsHuman NeutrophilsDifferentiated HL60 CellsUndifferentiated HL60 CellsBackground Correction
check_url/it/64971?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image