JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

Realtidsmätning av den mitokondriella bioenergetiska profilen för neutrofiler

Published: June 02, 2023
doi:
10.3791/64971
, ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program,Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Vi beskriver stegvisa protokoll som mäter mitokondriell andning hos mus- och humana neutrofiler och HL60-celler med hjälp av metabolisk extracellulär flödesanalysator.

Abstract

Neutrofiler är den första försvarslinjen och de vanligaste leukocyterna hos människor. Dessa effektorceller utför funktioner som fagocytos och oxidativ burst och skapar neutrofila extracellulära fällor (NET) för mikrobiell clearance. Nya insikter i neutrofilernas metaboliska aktiviteter utmanar det tidiga konceptet att de främst förlitar sig på glykolys. Exakt mätning av metaboliska aktiviteter kan utveckla olika metaboliska behov av neutrofiler, inklusive trikarboxylsyra (TCA) -cykeln (även känd som Krebs-cykeln), oxidativ fosforylering (OXPHOS), pentosfosfatväg (PPP) och fettsyraoxidation (FAO) under fysiologiska förhållanden och i sjukdomstillstånd. Detta dokument beskriver ett steg-för-steg-protokoll och förutsättningar för att mäta syreförbrukningshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell andning på benmärgshärledda neutrofiler från mus, humana blod-härledda neutrofiler och den neutrofilliknande HL60-cellinjen, med hjälp av metabolisk flödesanalys på en metabolisk extracellulär flödesanalysator. Denna metod kan användas för att kvantifiera mitokondriella funktioner hos neutrofiler under normala och sjukdomsförhållanden.

Introduction

Mitokondrier spelar en viktig roll i cellbioenergetik, som genererar adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS). Utöver detta sträcker sig mitokondriernas roll in i generering och avgiftning av reaktiva syrearter, cytoplasmatisk och mitokondriell matriskalciumreglering, cellulär syntes, katabolism och transport av metaboliter inom cellen1. Mitokondriell andning är avgörande i alla celler, eftersom deras dysfunktion kan leda till metaboliska problem 2, inklusive hjärt-kärlsjukdomar3 och en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration4, Parkinsons och Alzheimers sjukdomar5 och Charcot-Marie-Tooths sjukdom2 A (CMT2A)6.

Elektronmikroskopiska studier på neutrofiler avslöjade att det finns relativt få mitokondrier7, och de är starkt beroende av glykolys för sin energiproduktion eftersom mitokondriell andning är mycket låg8. Mitokondrier är dock avgörande för neutrofila funktioner, såsom kemotaxis9 och apoptos10,11,12. En tidigare studie avslöjade ett komplext mitokondriellt nätverk hos humana neutrofiler med hög membranpotential. Den mitokondriella membranpotentialförlusten är en tidig indikator på neutrofil apoptos10. Behandling med mitokondriell uncoupler karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) visade signifikant hämning i kemotaxi, tillsammans med en förändring i mitokondriell morfologi 9,10.

Även om den primära energikällan för neutrofiler är glykolys, tillhandahåller mitokondrier ATP som initierar neutrofilaktivering genom att driva den första fasen av purinergisk signalering, vilket ökar Ca2+ signalering, förstärker mitokondriell ATP-produktion och initierar neutrofila funktionella svar13. Dysfunktion i den mitokondriella andningskedjan resulterar i överdriven produktion av giftiga reaktiva syreradikaler (ROS) och leder till patogena skador14,15,16. NETosis, som är processen att bilda neutrofila extracellulära fällor (NET), är en kritisk egenskap hos neutrofiler som hjälper dem att bekämpa patogener17 och bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive cancer, trombos och autoimmuna störningar18. Mitokondriellt härledd ROS bidrar till NETosis19, mitokondriellt DNA kan vara en komponent i NET18 och förändrad mitokondriell homeostas försämrar NETosis 20,21,22,23,24. Dessutom, under normal differentiering eller mognad, vänds neutrofil metabolisk omprogrammering genom att begränsa glykolytisk aktivitet, och de engagerar sig i mitokondriell andning och mobiliserar intracellulära lipider25,26.

Den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn kan kontinuerligt övervaka och kvantifiera levande cellmitokondriell andning och glykolys. Analysatorn använder en sensorpatron med 96 brunnar och två fluoroforer för att kvantifiera syrekoncentration (O2) och pH-förändringar. Sensorpatronen ligger ovanför cellmonoskiktet under analysen och bildar en ~ 200 nm hög mikrokammare. De optiska fiberbuntarna i analysatorn används för att excitera fluoroforerna och detektera de fluorescerande intensitetsförändringarna. Realtidsförändringar i O2-koncentration och pH beräknas automatiskt och visas som syreförbrukningshastighet (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR). Det finns fyra portar på sensorpatronen som gör det möjligt att ladda upp till fyra föreningar i varje brunn under analysmätningarna. Detta protokoll fokuserar på att kvantifiera mitokondriell andning hos mus och humana neutrofiler, såväl som neutrofilliknande HL60-celler, med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn.

Protocol

Hepariniserade helblodprover erhölls från friska mänskliga givare efter att ha erhållit informerat samtycke, vilket godkänts av Institutional Review Board of UConn Health i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Alla djurförsök följde UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer, och godkännande för användning av gnagare erhölls från UConn Health IACUC enligt kriterier som beskrivs i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health. Möss av …

Representative Results

Representativ OCR-dynamik visas som indikerar mitokondriell andning förändringar som svar på oligomycin, FCCP och rotenon / antimycin En blandning av musneutrofiler (figur 3A), humana neutrofiler (figur 3B) och odifferentierade och differentierade HL60-celler (figur 3C). I alla celler minskar oligomycinbehandling OCR-värdet genom att hämma protonkanalen för ATP-syntas; FCCP-behandling återställer OCR-värdet genom att öka f…

Discussion

Standardproceduren som mäter mitokondriell andning av neutrofiler med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn begränsas av många faktorer, inklusive cellantal, celltillväxt och livskraft. Varje föreningskoncentration varierar beroende på typ och källa till celler i denna analys. Oligomycin och rotenon / antimycin A används mest i en liknande koncentration bland de flesta celltyper. Eftersom den FCCP-inducerade maximala andningsfrekvensen varierar mellan olika celler krävs dock noggrann titr…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi erkänner Dr. Anthony T. Vella och Dr. Federica Aglianoin från Institutionen för immunologi vid UConn Health för deras utbildning i att använda den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn och Dr. Lynn Puddington vid Institutionen för immunologi vid UConn Health för hennes stöd för instrumenten. Vi erkänner Dr. Geneva Hargis från UConn School of Medicine för hennes hjälp med vetenskapligt skrivande och redigering av detta manuskript. Denna forskning stöddes av bidrag från National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 och P20GM139763), en startfond från UConn Health och ett karriäråterinträdesstipendium från American Association of Immunologists.

Materials

37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -. W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. . Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019)
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020)
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer’s disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Keywords: Mitochondrial RespirationNeutrophilsHL60 CellsMetabolic Extracellular Flux AnalyzerMitochondrial FunctionCell Seeding DensityAssay MediumMouse NeutrophilsHuman NeutrophilsDifferentiated HL60 CellsUndifferentiated HL60 CellsBackground Correction
check_url/it/64971?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image