בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה
Summary
עבודה זו מפתחת בדיקת ספיגת נוגדנים להדמיית איתות תוך שושלת Notch/DeltaD בחלוקת אבות גליה רדיאלית במוח דג הזברה העוברי.
Abstract
חלוקת תאים אסימטרית (ACD), המייצרת שני תאי בת בעלי גורלות שונים, היא בסיסית ליצירת מגוון תאי. באיברים המתפתחים הן של חסרי חוליות והן של בעלי חוליות, חלוקה א-סימטרית של אבות יוצרת בת נוץ’היי המתחדשת מעצמה ובת נוץ’לו מבדילה. במוח של דגי זברה עובריים, אבות גליה רדיאלית (RGPs) – תאי הגזע העצביים העיקריים של בעלי החוליות – עוברים לרוב ACD כדי ללדת RGP אחד ותא עצב מתמיין אחד. הבהירות האופטית והנגישות הקלה של עוברי דגי זברה הופכות אותם לאידיאליים עבור הדמיה בהילוך מהיר in vivo כדי להמחיש ישירות כיצד ומתי אסימטריה של איתות Notch נוצרת במהלך ACD. מחקרים אחרונים הראו כי אנדוציטוזה דינמית של ליגנד Notch ligand DeltaD ממלאת תפקיד מכריע בקביעת גורל התא במהלך ACD, והתהליך מווסת על ידי וסת הקוטביות השמור אבולוציונית Par-3 (הידוע גם בשם Pard3) והקומפלקס המוטורי של הדיניין. כדי להמחיש את דפוסי הסחר in vivo של אנדוזומי איתות Notch ב-RGPs מיטוטיים, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים הזו. באמצעות הבדיקה, חשפנו את הדינמיקה של אנדוזומים המכילים DeltaD במהלך חלוקת RGP.
Introduction
איתות חריץ שולט בהחלטה ובדפוס של גורל התא במהלך ההתפתחות במטזואנים1, ומחקרים אחרונים הראו כי איתות Notch בחלוקת תאי גזע תלוי בעיקר בסחר אנדוציטי 2,3. Endocytosed Notch/Delta יכול להפעיל איתות Notch בגרעין ולשפר את השעתוק של גנים המטרה Notch 4,5,6. תנועה אנדוזומלית מסוג Directional Notch/Delta נצפתה לראשונה בתאי Drosophila sensory organy precursor (SOP) במהלך חלוקת התאים הא-סימטרית שלה (ACD), וכתוצאה מכך פעילות איתות Notch גבוהה יותר ב-pIIa מאשר ב-pIIb 7,8. בדיקות ספיגת נוגדנים עם נוגדנים אנטי דלתא ואנטי Notch יושמו כדי לפקח על התהליך האנדוציטי בתאי SOP מיטוטיים. אנדוזומים מסוג Notch/DeltaD נעים יחד עם חלבון קינזין מוטורי אל הציר המרכזי במהלך הציטוקינזיס, ועוברים טרנסלוקציה אסימטרית לתא pIIa עקב המערך האנטי-מקבילי של הציר המרכזי הא-סימטרי ברגע האחרון של חלוקת התא 3,8. מחקרים אלה שפכו אור על המנגנונים המולקולריים המווסתים חלוקה אסימטרית בתאי SOP דרוזופילה, אך לא ברור אם תהליכים אנדוציטיים דומים מתרחשים באבות גליה רדיאלית של בעלי חוליות (RGPs).
יתר על כן, המנגנונים המולקולריים המווסתים איתות Notch/DeltaD אסימטרי במהלך חלוקת RGP של בעלי חוליות אינם מובנים היטב. בדגי זברה, דווח כי האינטראקציה של Notch ו- Delta מקלה על אנדוציטוזה של ליגנד DeltaD9. לא ידוע אם אנדוציטוזה של DeltaD יכולה להשפיע על בחירת גורל התא של תאי בת במוח החוליות המתפתח. מחקרים אחרונים מראים כי הזרקת נוגדנים אנטי-דלתא-D מצומדים פלואורסצנטית לתוך הצינור העצבי יכולה לתייג אנדוזומי Sara באופן ספציפי בתאים נוירואפיתליאליים, ואנדוזומי אנטי-DeltaD המכילים Sara מפרידים באופן מועדף לתאי בת מתרבים10. הוצע כי איתות Notch מהאנדוזומים יכול לווסת את גורל תאי הבת. תוצאות קודמות הראו שרוב תאי RGP של דגי זברה במוח הקדמי המתפתח עוברים ACD, וקביעת גורל תאי הבת תלויה באיתות Notch/DeltaD11. על מנת להבהיר את טבעו של איתות Notch/DeltaD תוך שושלת בדגי זברה, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים נגד DeltaD במוח המתפתח של דגי זברה. באמצעות פרוטוקול זה, ביצענו בהצלחה תיוג חי והדמיה של סחר אנדוציטי DeltaD ב- RGPs מיטוטיים.
הנוגדן נגד DeltaD המסומן באופן פלואורסצנטי מופנם ביעילות לתוך RGPs לאורך החדר הקדמי במוח. זה הקל מאוד על גילוי הסחר הכיווני של אנדוזומי DeltaD בחלוקה אסימטרית של RGPs12,13. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים של ספיגת נוגדנים שפותחו עבור תרביות Drosophila notum וחוט השדרה 10 של דג הזברה, פרוטוקול זה השיג תיוג אנטי-DeltaD ארוך טווח ויעיל ביותר בשכבת תאי חדר המוח, במיוחד עם פחותמ-10 nL של תערובת נוגדנים במיקרו-הזרקה. הזרקת חדר המוח האחורי נוחה מאוד ליישום בדיקת ספיגת הנוגדנים במוח המתפתח, שכן חדר המוח האחורי מורחב היטב בעוברים של דגי זברה ומתמלא בנוזל מוחי שדרתי בשלב ההתפתחות המוקדם14. על ידי הזרקת תערובת הנוגדנים לחדר המוח האחורי מבלי לפגוע ברקמות מתפתחות חיוניות, הפרוטוקול מזער ככל האפשר נזק אפשרי לאזור הדימות במוח הקדמי. המינון המופחת של הנוגדן הראשוני המוזרק מנע גם מתופעות לוואי אפשריות של הפרעה לאיתות אנדוגני של Delta-Notch in vivo. פרוטוקול זה יכול להיות משולב בקלות עם הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות אחרות, בשימוש בשלבים התפתחותיים שונים, ואולי מותאם למוח הבוגר, כמו גם אורגנואידים מוח דו-ממדיים / תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. יחד, הפרוטוקול איפשר להבין כיצד ומתי נוצרת אסימטריה באיתות Notch במהלך ACD. האתגר העיקרי ליישום מוצלח של פרוטוקול זה הוא להשיג אספקה מדויקת של ריכוזים מתאימים של הנוגדן בהתבסס על תנאי ניסוי ספציפיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו בדיקת ספיגת נוגדנים לתיוג והדמיה של סחר אנדוזומלי Notch/Delta באבות גליה רדיאלית של דגי זברה ביעילות גבוהה. בהשוואה לשיטות קודמות ששימשו למעקב אחר נוגדנים מסומנים נגד DeltaD בתאי SOPדרוזופילה 7,8, השיטה שלנו השתמשה במיקרו-הזרקה במקום דגירה של דגימות בנוגדן המ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט נתמך על ידי NIH R01NS120218, פרס זרעי מרי אן קודה-קימבל של UCSF לחדשנות, וצ’אן צוקרברג Biohub.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. . Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -. Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. Journal of Visualized Experiments. (26), e1218 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
