Saggio di assorbimento degli anticorpi per il monitoraggio dell'endocitosi notch/delta durante la divisione asimmetrica dei progenitori della glia radiale del pesce zebra
Summary
Questo lavoro sviluppa un saggio di assorbimento degli anticorpi per l’imaging della segnalazione Notch/DeltaD intra-lineage nella divisione dei progenitori della glia radiale del cervello embrionale del pesce zebra.
Abstract
La divisione cellulare asimmetrica (ACD), che produce due cellule figlie di destini diversi, è fondamentale per generare diversità cellulare. Negli organi in via di sviluppo sia degli invertebrati che dei vertebrati, i progenitori che si dividono asimmetricamente generano una figlia auto-rinnovante diNotch hi e una figlia differenziante di Notch. Nel cervello embrionale del pesce zebra, i progenitori della glia radiale (RGP) – le principali cellule staminali neurali dei vertebrati – subiscono principalmente ACD per dare vita a un RGP e un neurone differenziante. La chiarezza ottica e la facile accessibilità degli embrioni di zebrafish li rendono ideali per l’imaging time-lapse in vivo per visualizzare direttamente come e quando l’asimmetria della segnalazione Notch viene stabilita durante l’ACD. Studi recenti hanno dimostrato che l’endocitosi dinamica del ligando di Notch DeltaD svolge un ruolo cruciale nella determinazione del destino cellulare durante l’ACD e il processo è regolato dal regolatore di polarità evolutivamente conservato Par-3 (noto anche come Pard3) e dal complesso motorio della dineina. Per visualizzare i modelli di traffico in vivo degli endosomi di segnalazione Notch negli RGP mitotici, abbiamo sviluppato questo test di assorbimento degli anticorpi. Utilizzando il test, abbiamo scoperto la dinamica degli endosomi contenenti DeltaD durante la divisione RGP.
Introduction
La segnalazione Notch controlla la decisione e il pattern del destino cellulare durante lo sviluppo nei metazoi1, e studi recenti hanno dimostrato che la segnalazione di Notch nella divisione delle cellule staminali dipende principalmente dal traffico endocitico 2,3. Notch/Delta endocitosato può attivare la segnalazione Notch nel nucleo e migliorare la trascrizione dei geni bersaglio di Notch 4,5,6. Il traffico endosomico Notch/Delta direzionale è stato osservato per la prima volta nelle cellule precursori degli organi sensoriali (SOP) della Drosophila durante la sua divisione cellulare asimmetrica (ACD), con conseguente maggiore attività di segnalazione di Notch in pIIa rispetto a pIIb 7,8. Sono stati applicati saggi di assorbimento degli anticorpi con anticorpi anti-Delta e anti-Notch per monitorare il processo endocitico nelle cellule SOP mitotiche. Gli endosomi Notch/DeltaD si spostano insieme ad una proteina motoria della kinesina verso il fuso centrale durante la citochinesi, e sono traslocati asimmetricamente nella cellula pIIa a causa della matrice antiparallela del fuso centrale asimmetrico all’ultimo momento della divisione cellulare 3,8. Questi studi hanno fatto luce sui meccanismi molecolari che regolano la divisione asimmetrica nelle cellule SOP di Drosophila, ma non è chiaro se processi endocitici simili si verifichino nei progenitori della glia radiale dei vertebrati (RGP).
Inoltre, i meccanismi molecolari che regolano la segnalazione asimmetrica Notch/DeltaD durante la divisione RGP dei vertebrati non sono ben compresi. Nel pesce zebra, è stato riportato che l’interazione di Notch e Delta facilita l’endocitosi del ligando DeltaD9. Non è noto se l’endocitosi DeltaD possa influire sulla scelta del destino cellulare delle cellule figlie nel cervello dei vertebrati in via di sviluppo. Studi recenti dimostrano che l’iniezione di anticorpi anti-DeltaD coniugati fluorescentmente nel tubo neurale potrebbe marcare gli endosomi Sara specificamente nelle cellule neuroepiteliali e gli endosomi Sara contenenti anti-DeltaD segregano preferenzialmente nelle cellule figlie proliferanti10. È stato suggerito che la segnalazione di Notch dagli endosomi potrebbe regolare il destino delle cellule figlie. Risultati precedenti hanno dimostrato che la maggior parte delle cellule RGP del pesce zebra nel proencefalo in via di sviluppo subiscono ACD e la determinazione del destino delle cellule figlie dipende dalla segnalazione Notch / DeltaD intralineage11. Al fine di chiarire la natura della segnalazione Notch/DeltaD intralineage negli RGP di zebrafish, abbiamo sviluppato il saggio di assorbimento degli anticorpi anti-DeltaD nel cervello in via di sviluppo del pesce zebra. Utilizzando questo protocollo, abbiamo eseguito con successo l’etichettatura in tempo reale e l’imaging del traffico endocitico DeltaD negli RGP mitotici.
L’anticorpo anti-DeltaD marcato con fluorescenza viene internalizzato in modo efficiente negli RGP lungo il ventricolo del proencefalo. Ha notevolmente facilitato la scoperta del traffico direzionale degli endosomi DeltaD nelle RGP12,13 che si dividono asimmetricamente. Rispetto ai precedenti protocolli di assorbimento degli anticorpi sviluppati per le colture di Drosophila notum e il midollo spinale zebrafish 10, questo protocollo ha raggiunto una marcatura anti-DeltaD duratura e altamente efficiente nello strato cellulare del ventricolo cerebrale, in particolare con meno di10 nL di miscela di anticorpi microiniettati. L’iniezione del ventricolo posteriore è molto conveniente per applicare il test di assorbimento degli anticorpi nel cervello in via di sviluppo, poiché il ventricolo del cervello posteriore è ben espanso negli embrioni di zebrafish e riempito di liquido cerebrospinale nella fase iniziale di sviluppo14. Iniettando la miscela di anticorpi nel ventricolo posteriore senza ferire alcun tessuto in via di sviluppo cruciale, il protocollo ha ridotto al minimo il più possibile i possibili danni alla zona di imaging nel proencefalo. Il dosaggio ridotto dell’anticorpo primario iniettato ha anche evitato potenziali effetti collaterali di interferire con la segnalazione endogena Delta-Notch in vivo. Questo protocollo può essere facilmente combinato con altre perturbazioni farmacologiche o genetiche, utilizzato in diversi stadi di sviluppo e possibilmente adattato al cervello adulto e agli organoidi cerebrali 2D / 3D derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Nel loro insieme, il protocollo ha permesso di capire come e quando l’asimmetria di segnalazione di Notch viene stabilita durante l’ACD. La sfida principale per il successo dell’implementazione di questo protocollo è quella di ottenere una consegna precisa di concentrazioni appropriate dell’anticorpo in base a specifiche condizioni sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato un test di assorbimento degli anticorpi per la marcatura e l’imaging del traffico endosomiale Notch/Delta nei progenitori della glia radiale del pesce zebra ad alta efficienza. Rispetto ai precedenti metodi utilizzati per tracciare l’anticorpo anti-DeltaD marcatonelle cellule SOP 7,8 di Drosophila, il nostro metodo ha utilizzato la microiniezione invece dell’incubazione dei campioni nell’anticorpo coniugato. Gli anticorpi anti-Dld coniugati flu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è stato supportato da NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation e Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
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