Questo lavoro sviluppa un saggio di assorbimento degli anticorpi per l'imaging della segnalazione Notch/DeltaD intra-lineage nella divisione dei progenitori della glia radiale del cervello embrionale del pesce zebra.
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Articolo metodologico
Saggio di assorbimento degli anticorpi per il monitoraggio dell'endocitosi notch/delta durante la divisione asimmetrica dei progenitori della glia radiale del pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
La divisione cellulare asimmetrica (ACD), che produce due cellule figlie di destini diversi, è fondamentale per generare diversità cellulare. Negli organi in via di sviluppo sia degli invertebrati che dei vertebrati, i progenitori che si dividono asimmetricamente generano una figlia auto-rinnovante diNotch hi e una figlia differenziante di Notch. Nel cervello embrionale del pesce zebra, i progenitori della glia radiale (RGP) - le principali cellule staminali neurali dei vertebrati - subiscono principalmente ACD per dare vita a un RGP e un neurone differenziante. La chiarezza ottica e la facile accessibilità degli embrioni di zebrafish li rendono ideali per l'imaging time-lapse in vivo per visualizzare direttamente come e quando l'asimmetria della segnalazione Notch viene stabilita durante l'ACD. Studi recenti hanno dimostrato che l'endocitosi dinamica del ligando di Notch DeltaD svolge un ruolo cruciale nella determinazione del destino cellulare durante l'ACD e il processo è regolato dal regolatore di polarità evolutivamente conservato Par-3 (noto anche come Pard3) e dal complesso motorio della dineina. Per visualizzare i modelli di traffico in vivo degli endosomi di segnalazione Notch negli RGP mitotici, abbiamo sviluppato questo test di assorbimento degli anticorpi. Utilizzando il test, abbiamo scoperto la dinamica degli endosomi contenenti DeltaD durante la divisione RGP.
Introduzione
La segnalazione Notch controlla la decisione e il pattern del destino cellulare durante lo sviluppo nei metazoi1, e studi recenti hanno dimostrato che la segnalazione di Notch nella divisione delle cellule staminali dipende principalmente dal traffico endocitico 2,3. Notch/Delta endocitosato può attivare la segnalazione Notch nel nucleo e migliorare la trascrizione dei geni bersaglio di Notch 4,5,6. Il traffico endosomico Notch/Delta direzionale è stato osservato per la prima volta nelle cellul....
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Protocollo
Abbiamo utilizzato la linea AB wild type e la linea transgenica Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] per lo studio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della California, San Francisco, USA (numero di approvazione: AN179000).
1. Preparazione di embrioni di zebrafish
- Prepara vasche di attraversamento dei pesci nel pomeriggio prima delle 17:00, con un pesce selvatico femmina e un pesce maschio Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] usando divisori per separarli in ogni vasca.
- Rimuovere i divisori prima delle 11:00 da tutt....
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Risultati
Nella Figura 2A, gli embrioni iniettati con Atto647N, senza legarsi con l'anticorpo primario, hanno mostrato fluorescenza di fondo nel ventricolo cerebrale. Pochissime particelle fluorescenti inghiottite possono essere osservate nelle cellule. Gli embrioni di zebrafish iniettati anti-Dld-Atto647N hanno mostrato grandi quantità di particelle fluorescenti internalizzate nella maggior parte delle cellule del proencefalo in via di sviluppo (Figura 2A, pannello di de.......
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Discussione
Abbiamo sviluppato un test di assorbimento degli anticorpi per la marcatura e l'imaging del traffico endosomiale Notch/Delta nei progenitori della glia radiale del pesce zebra ad alta efficienza. Rispetto ai precedenti metodi utilizzati per tracciare l'anticorpo anti-DeltaD marcatonelle cellule SOP 7,8 di Drosophila, il nostro metodo ha utilizzato la microiniezione invece dell'incubazione dei campioni nell'anticorpo coniugato. Gli anticorpi anti-Dld coniugati flu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto è stato supportato da NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation e Chan Zuckerberg Biohub.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto di coltura con fondo in vetro da 35 mm | Iniettore | MatTek corporation P35GC-1.5-10-C | |
| Narishige | IM300 | ||
| Anti-Topo-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| , diametro esterno 1,2 mm, diametro interno 0,9 mm, con filamento | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Disco rotante/campo largo ad alta velocità | Nikin | N/A | Nikon Microscopio a fluorescenza invertito Ti con confocale CSU-W1 ad ampio campo visivo. |
| Dumont Medical Pinzette Stile 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Estrattore P897 Marrone Fiammeggiante | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Micromanipolatori | ||
| World Precision Instruments | WPI M3301R | ||
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| tampone bloccante IgG di topo di Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| rosso fenolo | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaina | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM agarosio a basso punto di fusione | Invitrogen | 16520050 |
Riferimenti
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daed....
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Ristampe e permessi
