Dosage de l’absorption d’anticorps pour le suivi de l’endocytose cran/delta au cours de la division asymétrique des progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre
Summary
Ce travail développe un test d’absorption d’anticorps pour l’imagerie intra-lignée de la signalisation Notch / DeltaD dans la division des progéniteurs de la glie radiale du cerveau embryonnaire du poisson zèbre.
Abstract
La division cellulaire asymétrique (DCA), qui produit deux cellules filles de destins différents, est fondamentale pour générer la diversité cellulaire. Dans les organes en développement des invertébrés et des vertébrés, la division asymétrique des progéniteurs génère un Notchhi auto-renouvelant et un Notchlo différenciant une fille différenciatrice. Dans le cerveau embryonnaire du poisson-zèbre, les progéniteurs de la glie radiale (RGP) – les principales cellules souches neurales des vertébrés – subissent principalement une DCA pour donner naissance à un neurone RGP et un neurone différenciant. La clarté optique et la facilité d’accès des embryons de poisson zèbre les rendent idéaux pour l’imagerie in vivo en accéléré afin de visualiser directement comment et quand l’asymétrie de la signalisation Notch est établie pendant la DCA. Des études récentes ont montré que l’endocytose dynamique du ligand Notch DeltaD joue un rôle crucial dans la détermination du destin cellulaire pendant la DCA, et le processus est régulé par le régulateur de polarité conservé au cours de l’évolution Par-3 (également connu sous le nom de Pard3) et le complexe moteur de dynéine. Pour visualiser les schémas de trafic in vivo des endosomes de signalisation Notch dans les RGP mitotiques, nous avons développé ce test d’absorption d’anticorps. En utilisant le test, nous avons découvert la dynamique des endosomes contenant DeltaD pendant la division RGP.
Introduction
La signalisation Notch contrôle la décision et la structuration du destin cellulaire au cours du développement chez les métazoaires1, et des études récentes ont montré que la signalisation Notch dans la division des cellules souches dépend principalement du trafic endocytaire 2,3. Endocytosed Notch / Delta peut activer la signalisation Notch dans le noyau et améliorer la transcription des gènes ciblesNotch 4,5,6. Le trafic endosomal directionnel Notch/Delta a été observé pour la première fois dans les cellules précurseurs d’organes sensoriels (SOP) de la drosophile au cours de sa division cellulaire asymétrique (DCA), ce qui a entraîné une activité de signalisation Notch plus élevée dans pIIa que dans pIIb 7,8. Des tests d’absorption d’anticorps avec des anticorps anti-Delta et anti-Notch ont été appliqués pour surveiller le processus endocytaire dans les cellules SOP mitotiques. Les endosomes Notch/DeltaD se déplacent avec une protéine motrice kinésine vers le fuseau central pendant la cytocinèse et sont transloqués de manière asymétrique dans la cellule pIIa en raison du réseau antiparallèle du fuseau central asymétrique au dernier moment de la division cellulaire 3,8. Ces études ont mis en lumière les mécanismes moléculaires régulant la division asymétrique dans les cellules SOP de drosophile, mais il n’est pas clair si des processus endocytaires similaires se produisent chez les progéniteurs de la glie radiale des vertébrés (RGP).
De plus, les mécanismes moléculaires qui régulent la signalisation asymétrique Notch/DeltaD pendant la division RGP des vertébrés ne sont pas bien compris. Chez le poisson zèbre, il a été rapporté que l’interaction de Notch et Delta facilite l’endocytose du ligand9 DeltaD. On ne sait pas si l’endocytose DeltaD peut avoir un impact sur le choix du devenir cellulaire des cellules filles dans le cerveau des vertébrés en développement. Des études récentes montrent que l’injection d’anticorps anti-DeltaD conjugués par fluorescence dans le tube neural pourrait marquer les endosomes Sara spécifiquement dans les cellules neuroépithéliales, et les endosomes anti-DeltaD contenant Sara se séparent préférentiellement en cellules filles proliférantes10. Il a été suggéré que la signalisation Notch des endosomes pourrait réguler le destin des cellules filles. Des résultats antérieurs ont montré que la plupart des cellules RGP du poisson zèbre dans le cerveau antérieur en développement subissent une DCA et que la détermination du devenir des cellules filles dépend de la signalisation intralignée Notch / DeltaD11. Afin d’élucider la nature de la signalisation intralignée Notch / DeltaD dans les RGP du poisson zèbre, nous avons développé le test d’absorption des anticorps anti-DeltaD dans le cerveau en développement du poisson zèbre. En utilisant ce protocole, nous avons réalisé avec succès le marquage en direct et l’imagerie du trafic endocytaire DeltaD dans les RGP mitotiques.
L’anticorps anti-DeltaD marqué par fluorescence est efficacement internalisé dans les RGP le long du ventricule du cerveau antérieur. Il a grandement facilité la découverte du trafic directionnel des endosomes DeltaD dans les RGP à division asymétrique12,13. Par rapport aux protocoles précédents d’absorption d’anticorps développés pour les cultures de Drosophila notum et la moelle épinière du poisson zèbre 10, ce protocole a permis d’obtenir un marquage anti-DeltaD durable et très efficace dans la couche cellulaire du ventricule cérébral, en particulier avec moins de10 nL de mélange d’anticorps micro-injectés. L’injection du ventricule du cerveau postérieur est très pratique pour appliquer le test d’absorption des anticorps dans le cerveau en développement, car le ventricule du cerveau postérieur est bien élargi chez les embryons de poisson zèbre et rempli de liquide céphalorachidien au stadede développement précoce 14. En injectant le mélange d’anticorps dans le ventricule postérieur du cerveau sans blesser les tissus en développement cruciaux, le protocole a minimisé autant que possible les dommages possibles à la zone d’imagerie dans le cerveau antérieur. La dose réduite de l’anticorps primaire injecté a également évité les effets secondaires potentiels d’interférence avec la signalisation endogène Delta-Notch in vivo. Ce protocole peut être facilement combiné avec d’autres perturbations pharmacologiques ou génétiques, utilisé à différents stades de développement, et éventuellement adapté au cerveau adulte ainsi qu’aux organoïdes cérébraux 2D/3D dérivés de cellules souches pluripotentes humaines. Pris ensemble, le protocole a permis de comprendre comment et quand l’asymétrie de signalisation Notch est établie pendant l’ACD. Le principal défi pour une mise en œuvre réussie de ce protocole est d’obtenir une livraison précise de concentrations appropriées de l’anticorps en fonction de conditions expérimentales spécifiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé un test d’absorption d’anticorps pour le marquage et l’imagerie endosomale Notch/Delta trafic dans les progéniteurs de la glie radiale du poisson zèbre avec une grande efficacité. Par rapport aux méthodes précédentes utilisées pour suivre les anticorps anti-DeltaD marqués dans les cellules SOP de drosophile7,8, notre méthode a utilisé la micro-injection au lieu de l’incubation d’échantillons dans l’anticorps conjugué…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet a été soutenu par NIH R01NS120218, le prix Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation de l’UCSF et le Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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