Zebra Balığı Radyal Glia Progenitörlerinin Asimetrik Bölünmesi Sırasında Çentik / Delta Endositozunu İzlemek için Antikor Alım Testi
Summary
Bu çalışma, embriyonik zebra balığı beyninin radyal glia progenitörlerinin bölünmesinde soy içi Notch / DeltaD sinyalini görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirmektedir.
Abstract
Farklı kaderlere sahip iki yavru hücre üreten asimetrik hücre bölünmesi (ACD), hücresel çeşitlilik oluşturmak için temeldir. Hem omurgasızların hem de omurgalıların gelişmekte olan organlarında, asimetrik olarak bölünen progenitörler, bir Notchhi kendini yenileyen ve bir Notchlo farklılaştırıcı kızı üretir. Embriyonik zebra balığı beyninde, radyal glia progenitörleri (RGP’ler) – başlıca omurgalı nöral kök hücreleri – çoğunlukla bir RGP ve bir farklılaştırıcı nöron doğurmak için ACD’ye maruz kalırlar. Zebra balığı embriyolarının optik netliği ve kolay erişilebilirliği, ACD sırasında Çentik sinyalizasyonunun asimetrisinin nasıl ve ne zaman kurulduğunu doğrudan görselleştirmek için in vivo hızlandırılmış görüntüleme için idealdir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Notch ligand DeltaD’nin dinamik endositozunun ACD sırasında hücre kaderinin belirlenmesinde çok önemli bir rol oynadığını ve sürecin evrimsel olarak korunmuş polarite düzenleyicisi Par-3 (Pard3 olarak da bilinir) ve dinein motor kompleksi tarafından düzenlendiğini göstermiştir. Mitotik RGP’lerde Notch sinyal endozomlarının in vivo kaçakçılık paternlerini görselleştirmek için, bu antikor alım testini geliştirdik. Tahlil kullanarak, RGP bölünmesi sırasında DeltaD içeren endozomların dinamiğini ortaya çıkardık.
Introduction
Çentik sinyalizasyonu, metazoalarda1 gelişim sırasında hücre kaderi kararını ve modellemesini kontrol eder ve son çalışmalar, kök hücre bölünmesinde Çentik sinyallemesinin esas olarak endositik kaçakçılığa bağlı olduğunu göstermiştir 2,3. Endositozlu Çentik / Delta, çekirdekteki Çentik sinyallemesini aktive edebilir ve Çentik hedef genlerinin transkripsiyonunu artırabilir 4,5,6. Yönlü Çentik/Delta endozomal kaçakçılığı ilk olarak asimetrik hücre bölünmesi (ACD) sırasında Drosophila duyu organı öncüsü (SOP) hücrelerinde gözlendi ve pIIa’da pIIb 7,8’den daha yüksek bir Notch sinyal aktivitesi ile sonuçlandı. Mitotik SOP hücrelerinde endositik süreci izlemek için anti-Delta ve anti-Notch antikorları ile antikor alım testleri uygulanmıştır. Çentik/DeltaD endozomları, sitokinez sırasında bir kinesin motor proteini ile birlikte merkezi iş miline doğru hareket eder ve hücre bölünmesi 3,8’in son anında asimetrik merkezi milin antiparalel dizisi nedeniyle asimetrik olarak pIIa hücresine translokasyona uğrar. Bu çalışmalar, Drosophila SOP hücrelerinde asimetrik bölünmeyi düzenleyen moleküler mekanizmalara ışık tutmuştur, ancak omurgalı radyal glia progenitörlerinde (RGP’ler) benzer endositik süreçlerin meydana gelip gelmediği belirsizdir.
Ayrıca, omurgalı RGP bölünmesi sırasında asimetrik Çentik / DeltaD sinyallemesini düzenleyen moleküler mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır. Zebra balıklarında, Çentik ve Delta’nın etkileşiminin DeltaD ligand9’un endositozunu kolaylaştırdığı bildirilmiştir. DeltaD endositozunun gelişmekte olan omurgalı beynindeki yavru hücrelerin hücre kaderi seçimini etkileyip etkilemediği bilinmemektedir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, floresan olarak konjuge edilmiş anti-DeltaD antikorlarının nöral tüpe enjekte edilmesinin, Sara endozomlarını spesifik olarak nöroepitel hücrelerinde etiketleyebileceğini ve Sara endozomları içeren anti-DeltaD’nin tercihen çoğalan yavru hücrelere ayrıldığını göstermektedir10. Endozomlardan gelen Notch sinyallerinin yavru hücre kaderini düzenleyebileceği öne sürülmüştür. Önceki sonuçlar, gelişmekte olan ön beyindeki zebra balığı RGP hücrelerinin çoğunun ACD’ye maruz kaldığını ve yavru hücre kaderinin belirlenmesinin intralineage Notch / DeltaD sinyallemesine bağlı olduğunu göstermiştir11. Zebra balığı RGP’lerinde soy içi Çentik / DeltaD sinyallemesinin doğasını aydınlatmak için, zebra balığı gelişmekte olan beyinde anti-DeltaD antikor alım testini geliştirdik. Bu protokolü kullanarak, mitotik RGP’lerde DeltaD endositik kaçakçılığının canlı etiketlemesini ve görüntülemesini başarıyla gerçekleştirdik.
Floresan olarak etiketlenmiş anti-DeltaD-antikoru, ön beyin ventrikülü boyunca RGP’lere etkili bir şekilde içselleştirilir. Asimetrik olarak bölünen RGP’ler12,13’te DeltaD endozomlarının yönlü kaçakçılığının keşfedilmesini büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Drosophila notum kültürleri ve zebra balığı omuriliği 10 için geliştirilen önceki antikor alım protokolleriyle karşılaştırıldığında, bu protokol beyin ventrikül hücre tabakasında, özellikle10 nL’den az mikroenjeksiyonlu antikor karışımı ile uzun ömürlü ve yüksek etkili anti-DeltaD etiketlemesi sağlamıştır. Arka beyin ventrikül enjeksiyonu, gelişmekte olan beyinde antikor alım testini uygulamak için çok uygundur, çünkü arka beyin ventrikülü zebra balığı embriyolarında iyi genişlemiş ve erken gelişim aşamasında beyin omurilik sıvısı ile doldurulmuştur14. Antikor karışımını herhangi bir önemli gelişmekte olan dokuya zarar vermeden arka beyin ventrikülüne enjekte ederek, protokol ön beyindeki görüntüleme bölgesine olası hasarı mümkün olduğunca en aza indirmiştir. Enjekte edilen primer antikorun azaltılmış dozu, endojen Delta-Notch sinyallemesine in vivo müdahale etmenin potansiyel yan etkilerinden de kaçınmıştır. Bu protokol, diğer farmakolojik veya genetik bozulmalarla kolayca birleştirilebilir, farklı gelişim aşamalarında kullanılabilir ve muhtemelen yetişkin beynine ve insan pluripotent kök hücre kaynaklı 2D / 3D beyin organoidlerine uyarlanabilir. Birlikte ele alındığında, protokol ACD sırasında Notch sinyal asimetrisinin nasıl ve ne zaman kurulduğunu anlamayı mümkün kılmıştır. Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanmasındaki temel zorluk, spesifik deneysel koşullara dayanarak uygun antikor konsantrasyonlarının hassas bir şekilde verilmesini sağlamaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı radyal glia progenitörlerinde endozomal Notch / Delta kaçakçılığını yüksek verimlilikle etiketlemek ve görüntülemek için bir antikor alım testi geliştirdik. Drosophila SOP hücreleri 7,8’de etiketli anti-DeltaD antikorunu izlemek için kullanılan önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz konjuge antikordaki numunelerin inkübasyonu yerine mikroenjeksiyon kullanmıştır. Floresan konjuge anti-Dld antikorları a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proje, NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Tohum İnovasyon Ödülü ve Chan Zuckerberg Biohub tarafından desteklendi.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. . Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -. Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. Journal of Visualized Experiments. (26), e1218 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
