Antistoffopptaksanalyse for sporing av hakk/delta-endocytose under asymmetrisk deling av sebrafisk radiale glia-stamfedre

Summary

Dette arbeidet utvikler en antistoffopptaksanalyse for avbildning av intra-lineage Notch / DeltaD-signalering ved deling av radiale glia-forfedre til den embryonale sebrafiskhjernen.

Abstract

Asymmetrisk celledeling (ACD), som produserer to datterceller med forskjellige skjebner, er grunnleggende for å generere cellulært mangfold. I utviklingsorganene til både virvelløse dyr og virveldyr genererer asymmetrisk delende forfedre en Notch^hi selvfornyelse og en Notch^lo differensierende datter. I den embryonale sebrafiskhjernen gjennomgår radiale glia-forfedre (RP) – de viktigste virveldyrnevrale stamceller – for det meste ACD for å føde en RGP og en differensierende nevron. Den optiske klarheten og den enkle tilgjengeligheten til sebrafiskembryoer gjør dem ideelle for in vivo time-lapse-avbildning for direkte å visualisere hvordan og når asymmetrien til Notch-signalering etableres under ACD. Nylige studier har vist at dynamisk endocytose av Notch-liganden DeltaD spiller en avgjørende rolle i celleskjebnebestemmelse under ACD, og prosessen reguleres av den evolusjonært konserverte polaritetsregulatoren Par-3 (også kjent som Pard3) og dyneinmotorkomplekset. For å visualisere in vivo trafikkmønstre av Notch-signalendosomer i mitotiske RP-er, har vi utviklet denne antistoffopptaksanalysen. Ved hjelp av analysen har vi avdekket dynamikken til DeltaD-holdige endosomer under RGP-deling.

Introduction

Notch-signalering styrer celleskjebneavgjørelse og mønster under utvikling i metazoans¹, og nyere studier har vist at Notch-signalering i stamcelledeling hovedsakelig avhenger av endocytisk handel ^2,3. Endocytosed Notch/Delta kan aktivere Notch-signalering i kjernen og forbedre transkripsjonen av Notch-målgener ^4,5,6. Directional Notch/Delta endosomal trafficking ble først observert i Drosophila sensory organ precursor (SOP) celler under sin asymmetriske celledeling (ACD), noe som resulterte i en høyere Notch signaleringsaktivitet i pIIa enn i pIIb ^7,8. Antistoffopptaksanalyser med anti-Delta og anti-Notch antistoffer har blitt brukt for å overvåke endocytisk prosess i mitotiske SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer beveger seg sammen med et kinesinmotorprotein til den sentrale spindelen under cytokinese, og blir asymmetrisk translokalisert til pIIa-cellen på grunn av den antiparallelle matrisen til den asymmetriske sentrale spindelen i siste øyeblikk av celledeling ^3,8. Disse studiene har kastet lys over de molekylære mekanismene som regulerer asymmetrisk deling i Drosophila SOP-celler, men det er uklart om lignende endocytiske prosesser forekommer hos virveldyr radiale gliaprogenitorer (RP).

Videre er de molekylære mekanismene som regulerer asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under vertebrate RGP-divisjon ikke godt forstått. I sebrafisk har det blitt rapportert at samspillet mellom Notch og Delta letter endocytosen av DeltaD-liganden⁹. Det er ukjent om DeltaD endocytose kan påvirke celleskjebnevalget til datterceller i den utviklende virveldyrhjernen. Nylige studier viser at injeksjon av fluorescerende konjugerte anti-DeltaD-antistoffer i nevrale røret kan merke Sara-endosomer spesifikt i nevroepitelceller, og anti-DeltaD som inneholder Sara-endosomer fortrinnsvis segregerer til prolifererende datterceller¹⁰. Det har blitt foreslått at Notch-signalering fra endosomene kunne regulere dattercelleskjebnen. Tidligere resultater har vist at de fleste sebrafisk RGP-celler i den utviklende forhjernen gjennomgår ACD, og dattercelleskjebnebestemmelsen er avhengig av intralineage Notch/DeltaD-signalering¹¹. For å belyse arten av intralineage Notch/DeltaD-signalering hos fastleger for sebrafisk, har vi utviklet anti-DeltaD antistoffopptaksanalysen i den sebrafiskutviklende hjernen. Ved hjelp av denne protokollen har vi med hell utført live merking og avbildning av DeltaD endocytisk handel med mitotiske fastleger.

Det fluorescerende merkede anti-DeltaD-antistoffet internaliseres effektivt i fastlegene langs forhjerneventrikkelen. Det har i stor grad gjort det lettere å oppdage retningsbestemt handel med DeltaD-endosomer i de asymmetrisk delende fastlegene^12,13. Sammenlignet med tidligere antistoffopptaksprotokoller utviklet for Drosophila notumkulturer og sebrafiskryggmargen 10, har denne protokollen oppnådd langvarig og svært effektiv anti-DeltaD-merking i hjerneventrikkelcellelaget, spesielt med mindre enn¹⁰ nL mikroinjisert antistoffblanding. Bakhjernens ventrikkelinjeksjon er veldig praktisk for påføring av antistoffopptaksanalysen i den utviklende hjernen, da bakhjernens ventrikkel er godt utvidet i sebrafiskembryoer og fylt opp med cerebrospinalvæske i tidlig utviklingsstadium¹⁴. Ved å injisere antistoffblandingen i bakhjernens ventrikkel uten å skade noe avgjørende utviklende vev, har protokollen minimert mulig skade på bildesonen i forhjernen så mye som mulig. Den reduserte dosen av det injiserte primære antistoffet har også unngått potensielle bivirkninger ved å forstyrre endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Denne protokollen kan enkelt kombineres med andre farmakologiske eller genetiske forstyrrelser, utnyttes på forskjellige utviklingsstadier, og muligens tilpasses den voksne hjernen så vel som humane pluripotente stamcelleavledede 2D / 3D hjerneorganoider. Samlet sett har protokollen gjort det mulig å forstå hvordan og når Notch-signalasymmetri etableres under ACD. Hovedutfordringen for vellykket implementering av denne protokollen er å oppnå presis levering av passende konsentrasjoner av antistoffet basert på spesifikke eksperimentelle forhold.

Protocol

Vi har brukt AB villtypelinje og transgen linje Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] for studien. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco, USA (godkjenningsnummer: AN179000). 1. Fremstilling av sebrafiskembryoer Sett opp fiskekryssingstanker om ettermiddagen før kl. 17.00, med en hunnfisk av villtype og en hannfisk av villtype [ ef1a:Myr-Tdtomato] fisk ved å bruke skilleveg…

Representative Results

I figur 2A viste embryoene injisert med Atto647N, uten binding med det primære antistoffet, bakgrunnsfluorescens i hjerneventrikkelen. Svært få oppslukte fluorescerende partikler kan observeres i cellene. De anti-Dld-Atto647N-injiserte sebrafiskembryoene viste store mengder internaliserte fluorescerende partikler i de fleste cellene i den utviklende forhjernen (figur 2A, høyre panel). Etter å ha zoomet inn for å fokusere på mitotiske fastleger, som vist i…

Discussion

Vi har utviklet en antistoffopptaksanalyse for merking og avbildning av endosomal Notch/Delta-handel med sebrafisk radiale glia-forfedre med høy effektivitet. Sammenlignet med tidligere metoder brukt for sporing av merket anti-DeltaD antistoff i Drosophila SOP celler^7,8, brukte vår metode mikroinjeksjon i stedet for inkubasjon av prøver i det konjugerte antistoffet. Fluorescerende konjugerte anti-Dld-antistoffer ble mikroinjisert i bakhjernens ventrikkel; Denn…

Materials

35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050