Анализ поглощения антител для отслеживания эндоцитоза Notch/Delta во время асимметричного деления предшественников радиальной глии рыбок данио-рерио
Summary
В этой работе разработан анализ поглощения антител для визуализации внутриродословной передачи сигналов Notch/DeltaD при делении предшественников радиальной глии эмбрионального мозга рыбок данио.
Abstract
Асимметричное деление клеток (ACD), в результате которого образуются две дочерние клетки с разной судьбой, имеет основополагающее значение для создания клеточного разнообразия. В развивающихся органах как беспозвоночных, так и позвоночных асимметрично делящиеся прародители порождают самообновляющуюся дочь Notchhi и дифференцирующую дочь Notchlo . В эмбриональном мозге рыбок данио-рерио предшественники радиальной глии (RGP) – основные нервные стволовые клетки позвоночных – в основном подвергаются ACD, чтобы родить один RGP и один дифференцирующий нейрон. Оптическая прозрачность и легкий доступ к эмбрионам рыбок данио-рерио делают их идеальными для покадровой визуализации in vivo , чтобы непосредственно визуализировать, как и когда устанавливается асимметрия передачи сигналов Notch во время ACD. Недавние исследования показали, что динамический эндоцитоз лиганда Notch DeltaD играет решающую роль в определении судьбы клеток во время ACD, и этот процесс регулируется эволюционно консервативным регулятором полярности Par-3 (также известным как Pard3) и моторным комплексом динеина. Чтобы визуализировать паттерны транспортировки in vivo сигнальных эндосом Notch в митотических RGP, мы разработали этот анализ поглощения антител. С помощью анализа мы обнаружили динамику DeltaD-содержащих эндосом при делении RGP.
Introduction
Передача сигналов Notch контролирует решение о судьбе клеток и формирование паттернов во время развития у многоклеточных1, и недавние исследования показали, что передача сигналов Notch при делении стволовых клеток в основном зависит от эндоцитарного трафика 2,3. Эндоцитозированные Notch/Delta могут активировать передачу сигналов Notch в ядре и усиливать транскрипцию генов-мишеней Notch 4,5,6. Направленный эндосомальный трафик Notch/Delta впервые наблюдался в клетках-предшественниках органов чувств (SOP) дрозофилы во время ее асимметричного деления клеток (ACD), что привело к более высокой сигнальной активности Notch в pIIa, чем в pIIb 7,8. Анализы поглощения антител с антителами анти-Дельта и анти-Notch были применены для мониторинга эндоцитарного процесса в митотических клетках СОП. Эндосомы Notch/DeltaD перемещаются вместе с кинезиновым моторным белком к центральному веретену во время цитокинеза и асимметрично транслоцируются в клетку pIIa из-за антипараллельного массива асимметричного центрального веретена в последний момент деленияклетки 3,8. Эти исследования пролили свет на молекулярные механизмы, регулирующие асимметричное деление в клетках SOP дрозофилы, но неясно, происходят ли подобные эндоцитарные процессы у предшественников радиальной глии позвоночных (RGP).
Более того, молекулярные механизмы, которые регулируют асимметричную передачу сигналов Notch/DeltaD во время деления RGP позвоночных, недостаточно изучены. Сообщалось, что у рыбок данио-рерио взаимодействие Notch и Delta способствует эндоцитозу лигандаDeltaD 9. Неизвестно, может ли эндоцитоз DeltaD влиять на выбор дочерних клеток в развивающемся мозге позвоночных. Недавние исследования показывают, что инъекция флуоресцентно конъюгированных антител против DeltaD в нервную трубку может маркировать эндосомы Sara специфически в нейроэпителиальных клетках, а эндосомы, содержащие анти-DeltaD, предпочтительно разделяются на пролиферирующие дочерние клетки10. Было высказано предположение, что передача сигналов Notch от эндосом может регулировать судьбу дочерних клеток. Предыдущие результаты показали, что большинство RGP-клеток рыбок данио-рерио в развивающемся переднем мозге подвергаются ACD, а определение судьбы дочерних клеток зависит от внутриродословной передачи сигналов Notch/DeltaD11. Чтобы выяснить природу внутрилинии передачи сигналов Notch/DeltaD в RGP рыбок данио, мы разработали анализ поглощения антител против DeltaD в развивающемся мозге рыбок данио. Используя этот протокол, мы успешно выполнили живую маркировку и визуализацию эндоцитарного трафика DeltaD в митотических RGP.
Флуоресцентно меченное анти-DeltaD-антитело эффективно интернализуется в RGP вдоль желудочка переднего мозга. Это значительно облегчило обнаружение направленного трафика эндосом DeltaD в асимметрично делящихся RGPs12,13. По сравнению с предыдущими протоколами поглощения антител, разработанными для культур Drosophila notum и спинного мозгарыбок данио-рерио 10, этот протокол обеспечил длительную и высокоэффективную маркировку анти-DeltaD в клеточном слое желудочка головного мозга, в частности, с менее чем 10 нл смеси микроинъекционных антител. Инъекция в задний желудочек головного мозга очень удобна для применения анализа поглощения антител в развивающемся мозге, так как желудочек заднего мозга хорошо расширен у эмбрионов рыбок данио-рерио и заполнен спинномозговой жидкостью на ранней стадииразвития 14. Вводя смесь антител в желудочек заднего мозга, не повреждая какие-либо важные развивающиеся ткани, протокол максимально минимизировал возможное повреждение зоны визуализации в переднем мозге. Уменьшенная доза вводимого первичного антитела также позволила избежать потенциальных побочных эффектов вмешательства в эндогенную передачу сигналов Delta-Notch in vivo. Этот протокол можно легко комбинировать с другими фармакологическими или генетическими возмущениями, использовать на разных стадиях развития и, возможно, адаптировать к взрослому мозгу, а также к 2D/3D органоидам мозга, полученным из плюрипотентных стволовых клеток человека. В совокупности протокол позволил понять, как и когда устанавливается асимметрия сигнализации Notch во время ACD. Основной задачей для успешной реализации этого протокола является достижение точной доставки соответствующих концентраций антитела на основе конкретных экспериментальных условий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали анализ поглощения антител для маркировки и визуализации эндосомального трафика Notch/Delta у предшественников радиальной глии рыбок данио-рерио с высокой эффективностью. По сравнению с предыдущими методами, используемыми для отслеживания меченых антител против DeltaD в клетк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект был поддержан NIH R01NS120218, премией UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award за инновации и Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. . Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -. Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. Journal of Visualized Experiments. (26), e1218 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
