Dette arbejde udvikler et antistofoptagelsesassay til billeddannelse af intra-afstamning Notch/DeltaD-signalering ved opdeling af radiale glia-forfædre til den embryonale zebrafiskhjerne.
Asymmetrisk celledeling (ACD), som producerer to datterceller af forskellige skæbner, er grundlæggende for at generere cellulær mangfoldighed. I de udviklende organer hos både hvirvelløse dyr og hvirveldyr genererer asymmetrisk delende forfædre et hakhej selvfornyende og et haktil differentierende datter. I den embryonale zebrafiskhjerne gennemgår radiale glia-forfædre (RGP’er) – de vigtigste neurale stamceller fra hvirveldyr – for det meste ACD for at føde en RGP og en differentierende neuron. Den optiske klarhed og nemme tilgængelighed af zebrafiskembryoner gør dem ideelle til in vivo time-lapse-billeddannelse til direkte visualisering af, hvordan og hvornår asymmetrien af Notch-signalering etableres under ACD. Nylige undersøgelser har vist, at dynamisk endocytose af Notch ligand DeltaD spiller en afgørende rolle i bestemmelse af celleskæbne under ACD, og processen reguleres af den evolutionært bevarede polaritetsregulator Par-3 (også kendt som Pard3) og dyneinmotorkomplekset. For at visualisere in vivo-handelsmønstrene for Notch-signalendosomer i mitotiske RGP’er har vi udviklet denne antistofoptagelsesanalyse. Ved hjælp af analysen har vi afdækket dynamikken i DeltaD-holdige endosomer under RGP-division.
Notch-signalering styrer celleskæbnebeslutning og mønster under udvikling i metazoer1, og nylige undersøgelser har vist, at Notch-signalering i stamcelledeling hovedsageligt afhænger af endocytisk handel 2,3. Endocytosed Notch / Delta kan aktivere Notch-signalering i kernen og forbedre transkriptionen af Notch-målgener 4,5,6. Retningsbestemt hak / Delta endosomal handel blev først observeret i Drosophila sensoriske organforløberceller (SOP) under dets asymmetriske celledeling (ACD), hvilket resulterede i en højere Notch-signalaktivitet i pIIa end i pIIb 7,8. Antistofoptagelsesassays med anti-Delta og anti-Notch antistoffer er blevet anvendt til at overvåge den endocytiske proces i mitotiske SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer bevæger sig sammen med et kinesinmotorprotein til den centrale spindel under cytokinese og translokeres asymmetrisk ind i pIIa-cellen på grund af det antiparallelle array af den asymmetriske centrale spindel i sidste øjeblik af celledeling 3,8. Disse undersøgelser har kastet lys over de molekylære mekanismer, der regulerer asymmetrisk opdeling i Drosophila SOP-celler, men det er uklart, om lignende endocytiske processer forekommer i vertebrat radiale glia-forfædre (RGP’er).
Desuden er de molekylære mekanismer, der regulerer asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under hvirveldyrs RGP-deling, ikke godt forstået. I zebrafisk er det blevet rapporteret, at interaktionen mellem Notch og Delta letter endocytose af DeltaD-liganden9. Det vides ikke, om DeltaD-endocytose kan påvirke celleskæbnevalget af datterceller i den udviklende hvirveldyrhjerne. Nylige undersøgelser viser, at injektion af fluorescerende konjugerede anti-DeltaD-antistoffer i neuralrøret kunne mærke Sara-endosomer specifikt i neuroepitelceller, og anti-DeltaD indeholdende Sara-endosomer adskilles fortrinsvis i prolifererende datterceller10. Det er blevet foreslået, at Notch-signalering fra endosomerne kunne regulere dattercelleskæbnen. Tidligere resultater har vist, at de fleste zebrafisk RGP-celler i den udviklende forhjerne gennemgår ACD, og dattercellens skæbnebestemmelse er afhængig af intralineage Notch/DeltaD signalering11. For at belyse karakteren af intralineage Notch/DeltaD signaleringen i zebrafisk RGP’er, har vi udviklet anti-DeltaD antistof uptake assay i zebrafiskens udviklende hjerne. Ved hjælp af denne protokol har vi med succes udført live mærkning og billeddannelse af DeltaD endocytisk handel med mitotiske RGP’er.
Det fluorescerende mærkede anti-DeltaD-antistof internaliseres effektivt i RGP’erne langs forhjernens ventrikel. Det har i høj grad lettet opdagelsen af retningsbestemt handel med DeltaD-endosomer i de asymmetrisk opdelte RGP’er12,13. Sammenlignet med tidligere antistofoptagelsesprotokoller udviklet til Drosophila notumkulturer og zebrafiskens rygmarv 10, har denne protokol opnået langvarig og yderst effektiv anti-DeltaD-mærkning i hjernens ventrikelcellelag, specifikt med mindre end10 nL mikroinjiceret antistofblanding. Injektionen af baghjernens ventrikel er meget praktisk til anvendelse af antistofoptagelsesanalysen i den udviklende hjerne, da baghjernens ventrikel er godt udvidet i zebrafiskembryoner og fyldt op med cerebrospinalvæske i det tidlige udviklingsstadium14. Ved at injicere antistofblandingen i baghjernens ventrikel uden at skade afgørende udviklende væv, har protokollen minimeret mulig skade på billeddannelseszonen i forhjernen så meget som muligt. Den reducerede dosis af det injicerede primære antistof har også undgået potentielle bivirkninger ved at forstyrre endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Denne protokol kan let kombineres med andre farmakologiske eller genetiske forstyrrelser, der anvendes på forskellige udviklingsstadier og muligvis tilpasses den voksne hjerne såvel som humane pluripotente stamcelleafledte 2D / 3D hjerneorganoider. Samlet set har protokollen gjort det muligt at forstå, hvordan og hvornår Notch-signalasymmetri etableres under ACD. Den største udfordring for en vellykket gennemførelse af denne protokol er at opnå præcis levering af passende koncentrationer af antistoffet baseret på specifikke eksperimentelle betingelser.
Vi har udviklet et antistofoptagelsesassay til mærkning og billeddannelse af endosomal Notch/Delta handel med zebrafisk radiale glia-forfædre med høj effektivitet. Sammenlignet med tidligere metoder, der blev brugt til sporing af mærket anti-DeltaD-antistof i Drosophila SOP-celler7,8, brugte vores metode mikroinjektion i stedet for inkubation af prøver i det konjugerede antistof. Fluorescerende konjugerede anti-DLD-antistoffer blev mikroinjiceret i baghjerne…
The authors have nothing to disclose.
Projektet blev støttet af NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation og Chan Zuckerberg Biohub.
35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
air pressure injector | Narishige | IM300 | |
Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
KCl | Millipore | 529552 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |