Tavuk Embriyolarında İntralomik Transplantasyon Yoluyla Böbrek Organoidlerinin Etkin Vaskülarizasyonu
Summary
Burada, tavuk embriyolarının selomik boşluğunda böbrek organoidlerinin transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler ve bu süreçleri verimli bir şekilde incelemek için kullanılabilir.
Abstract
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen böbrek organoidleri, yetişkin böbrektekine belirli bir dereceye kadar benzeyen nefron benzeri yapılar içerir. Ne yazık ki, klinik uygulanabilirlikleri fonksiyonel bir vaskülatür eksikliği ve sonuç olarak in vitro olgunlaşmanın sınırlı olması nedeniyle engellenmektedir. Tavuk embriyolarının selomik boşluğundaki böbrek organoidlerinin transplantasyonu, glomerüler kılcal damarların oluşumu da dahil olmak üzere perfüze edilmiş kan damarları tarafından vaskülarizasyonu indükler ve olgunlaşmalarını arttırır. Bu teknik çok etkilidir ve çok sayıda organoidin transplantasyonuna ve analizine izin verir. Bu yazıda, tavuk embriyolarında böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için ayrıntılı bir protokol, ardından perfüze edilen vaskülatürü boyamak için floresan olarak etiketlenmiş lektin enjeksiyonu ve görüntüleme analizi için nakledilen organoidlerin toplanması açıklanmaktadır. Bu yöntem, in vitro olarak bu süreçleri geliştirmek ve hastalık modellemesini geliştirmek için ipuçları bulmak üzere organoid vaskülarizasyon ve olgunlaşmayı indüklemek ve incelemek için kullanılabilir.
Introduction
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı böbrek organoidlerinin gelişimsel çalışmalariçin potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir 1,2,3,4, toksisite taraması 5,6 ve hastalık modelleme 5,7,8,9,10,11,12,13 . Bununla birlikte, bunlar ve nihai klinik transplantasyon amaçları için uygulanabilirlikleri, vasküler bir ağın olmaması nedeniyle sınırlıdır. Embriyonik böbrek gelişimi sırasında, podositler, mezangial hücreler ve vasküler endotel hücreleri (ECs), glomerulusun karmaşık yapısını oluşturmak için etkileşime girer. Bu etkileşim olmadan, podositler, glomerüler bazal membran (GBM) ve ECs’den oluşan glomerüler filtrasyon bariyeri düzgün bir şekilde gelişemez14,15,16. İn vitro böbrek organoidleri bazı EC’ler içermesine rağmen, bunlar uygun bir vasküler ağ oluşturamaz ve zamanla azalır17. Bu nedenle organoidlerin olgunlaşmamış kalması şaşırtıcı değildir. Farelerde transplantasyon, böbrek organoidlerinin vaskülarizasyonunu ve olgunlaşmasını indükler 18,19,20,21. Ne yazık ki, bu, çok sayıda organoidin analizi için uygun olmayan emek yoğun bir süreçtir.
Tavuk embriyoları, bir yüzyıldan fazla bir süredir vaskülarizasyon ve gelişimi incelemek için kullanılmıştır22. Kolayca erişilebilirler, düşük bakım gerektirirler, tamamen işlevsel bir bağışıklık sisteminden yoksundurlar ve yumurta kabuğunu açtıktan sonra normal olarak gelişebilirler23,24,25,26. Organoidlerin koryoallantoik membran (CAM) transplantasyonunun vaskülarizasyona yol açtığı gösterilmiştir27. Bununla birlikte, CAM üzerindeki transplantasyon süresi ve greftin olgunlaşma seviyesi, tamamlanması embriyonik gün 7’ye kadar süren CAM oluşumu ile sınırlıdır. Bu nedenle, son zamanlarda tavuk embriyolarında intrasemik transplantasyon yoluyla böbrek organoidlerini etkili bir şekilde vaskülarize etmek ve olgunlaştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir28. Tavuk embriyolarının selomik boşluğunun 1930’lardan beri embriyonik dokuların farklılaşması için elverişli bir ortam olduğu bilinmektedir29,30. Embriyonik gelişimin erken dönemlerinde erişilebilir ve greftin her yöne nispeten sınırsız genişlemesine izin verir.
Bu yazıda, hiPSC türevi böbrek organoidlerinin 4. gün tavuk embriyolarının selomik boşluğunda transplantasyonu için bir protokol özetlenmiştir. Bu yöntem, 8 gün içinde organoidlerin vaskülarizasyonunu ve gelişmiş olgunlaşmasını indükler. Embriyoları feda etmeden önce floresan etiketli lens culinaris aglutinin (LCA) enjeksiyonu, konfokal mikroskopi ile organoidler içindeki perfüze kan damarlarının görüntülenmesini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, tavuk embriyolarında hiPSC türevi böbrek organoidlerinin intrasemik transplantasyonu için bir protokol gösterilmiştir. Transplantasyon üzerine, organoidler, insan organoid kaynaklı ve tavuk kaynaklı ECs’nin bir kombinasyonundan oluşan perfüze kan damarları tarafından vaskülarize edilir. Bunlar organoid boyunca yayılır ve glomerüler yapıları istila ederek ECs ve podositler arasında etkileşimi sağlar. Daha önce bunun organoid glomerüler ve tübüler yapıların olgunlaşmasının artmas?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
George Galaris’e (LUMC, Leiden, Hollanda) tavuk embriyosu enjeksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Saskia van der Wal-Maas (Anatomi ve Embriyoloji Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda), Conny van Munsteren (Anatomi ve Embriyoloji Bölümü, LUMC, Leiden, Hollanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Hollanda) ve Annemarie de Graaf’ın (LUMC, Leiden, Hollanda) desteklerini kabul ediyoruz. M. Koning, ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’ tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma kısmen Leiden Üniversitesi Fonu “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fonu” GWF2019-02 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Rejeneratif Tıp Sınırları Aşan (RegMedXB) ve Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health ortakları tarafından desteklenmektedir. C.W. van den Berg ve T.J. Rabelink, Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi (reNEW), Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi, Novo Nordisk Vakfı hibeleri (NNF21CC0073729) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
- . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).
