Summary

Efficiënte vascularisatie van nierorganoïden door intracelomische transplantatie in kippenembryo's

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo’s. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen en kan worden gebruikt om deze processen op een efficiënte manier te bestuderen.

Abstract

Nierorganoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen bevatten nefronachtige structuren die tot op zekere hoogte lijken op die in de volwassen nier. Helaas wordt hun klinische toepasbaarheid belemmerd door het ontbreken van een functionele vasculatuur en bijgevolg beperkte rijping in vitro. De transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo’s induceert vascularisatie door geperfuseerde bloedvaten, inclusief de vorming van glomerulaire haarvaten, en verbetert hun rijping. Deze techniek is zeer efficiënt, waardoor de transplantatie en analyse van grote aantallen organoïden mogelijk is. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de intracelomische transplantatie van nierorganoïden in kippenembryo’s, gevolgd door de injectie van fluorescerend gelabeld lectine om de perfuseerde vasculatuur te kleuren en de verzameling getransplanteerde organoïden voor beeldvormingsanalyse. Deze methode kan worden gebruikt om organoïde vascularisatie en rijping te induceren en te bestuderen om aanwijzingen te vinden voor het verbeteren van deze processen in vitro en het verbeteren van ziektemodellering.

Introduction

Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)-afgeleide nierorganoïden is aangetoond dat ze potentieel hebben voor ontwikkelingsstudies 1,2,3,4, toxiciteitsscreening 5,6 en ziektemodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Hun toepasbaarheid voor deze en eventuele klinische transplantatiedoeleinden wordt echter beperkt door het ontbreken van een vasculair netwerk. Tijdens de embryonale nierontwikkeling interageren podocyten, mesangiale cellen en vasculaire endotheelcellen (EC’s) om de ingewikkelde structuur van de glomerulus te vormen. Zonder deze interactie kan de glomerulaire filtratiebarrière, bestaande uit podocyten, het glomerulaire keldermembraan (GBM) en EC’s, zich niet goed ontwikkelen14,15,16. Hoewel nierorganoïden in vitro sommige EC’s bevatten, vormen deze geen goed vasculair netwerk en verminderen ze na verloop van tijd17. Het is dan ook niet verwonderlijk dat de organoïden onvolgroeid blijven. Transplantatie bij muizen induceert vascularisatie en rijping van de nierorganoïden 18,19,20,21. Helaas is dit een arbeidsintensief proces dat niet geschikt is voor de analyse van grote aantallen organoïden.

Kippenembryo’s worden al meer dan een eeuw gebruikt om vascularisatie en ontwikkeling te bestuderen22. Ze zijn gemakkelijk toegankelijk, vereisen weinig onderhoud, missen een volledig functioneel immuunsysteem en kunnen zich normaal ontwikkelen na het openen van de eierschaal23,24,25,26. De transplantatie van organoïden op hun chorioallantoïsche membraan (CAM) heeft aangetoond dat het leidt tot vascularisatie27. De duur van de transplantatie op de CAM, evenals het niveau van rijping van het transplantaat, worden echter beperkt door CAM-vorming, die tot embryonale dag 7 duurt om te voltooien. Daarom is onlangs een methode ontwikkeld om nierorganoïden efficiënt te vasculariseren en rijpen door intracelomische transplantatie in kippenembryo’s28. De celomische holte van kippenembryo’s is sinds de jaren 1930 bekend als een gunstige omgeving voor de differentiatie van embryonale weefsels29,30. Het is vroeg in de embryonale ontwikkeling toegankelijk en maakt een relatief onbeperkte uitbreiding van het transplantaat in alle richtingen mogelijk.

Dit artikel schetst een protocol voor de transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in de celomische holte van dag 4 kippenembryo’s. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen. Injectie van fluorescerend gelabelde lens culinaris agglutinine (LCA) voorafgaand aan het opofferen van de embryo’s maakt visualisatie van geperfuseerde bloedvaten in de organoïden mogelijk door middel van confocale microscopie.

Protocol

Volgens de Nederlandse wet was voor dit onderzoek geen goedkeuring van de dierenwelzijnscommissie nodig. 1. Voorbereiden van hiPSC-afgeleide nierorganoïden voor transplantatie Differentieer hiPSC’s tot nierorganoïden met behulp van het protocol ontwikkeld door Takasato et al.4,18,31. Kweek de organoïden volgens dit protocol op polyester celkweekinzetstukken met 0,4 μm po…

Representative Results

De methode en tijdlijn voor de differentiatie van hiPSC’s naar nierorganoïden, incubatie van bevruchte kippeneieren, transplantatie van nierorganoïden, injectie van LCA en verzameling van de organoïden zijn samengevat in figuur 1A. Het is belangrijk om de timing van organoïde differentiatie en kippenei-incubatie te coördineren, waarbij differentiatie 15 dagen vóór de incubatie wordt gestart. De acties op dag 0, 3, 4 en 12 van de incubatie worden geïllustreerd met foto’s onder de tij…

Discussion

In dit manuscript wordt een protocol voor intracelomische transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in kippenembryo’s gedemonstreerd. Bij transplantatie worden organoïden gevasculariseerd door geperfuseerde bloedvaten die bestaan uit een combinatie van van menselijke organoïden afgeleide en van kippen afgeleide EC’s. Deze zijn verspreid over de organoïde en dringen de glomerulaire structuren binnen, waardoor interactie tussen de EC’s en podocyten mogelijk wordt. Eerder werd aangetoond dat dit leidt tot een ve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken George Galaris (LUMC, Leiden) voor zijn hulp bij de injectie van kippenembryo’s. We erkennen de steun van Saskia van der Wal-Maas (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) en Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning wordt ondersteund door ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door het Leids Universiteits Fonds “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fonds” GWF2019-02. Dit werk wordt ondersteund door de partners van Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) en Health Holland, Topsector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg en T.J. Rabelink worden ondersteund door The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wordt ondersteund door Novo Nordisk Foundation grants (NNF21CC0073729).

Materials

0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm Whatman 10462200
35 mm glass bottom dishes  MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope  Leica TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC090-11
Dissecting microscope  Wild Heerbrugg 355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp Hammacher Karl HAMMHSB391-10
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-212-02 dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-21448 dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades Electron Microsopy Sciences 72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) ThermoFisher Scientific 14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) ThermoFisher Scientific 14190094
Egg cartons or custom made egg holders  NA NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus Drost Loosdrecht B.V. NA
Incubator Elbanton BV ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated Vector Laboratories B-1325 dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm Hammacher Karl HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament World Precision Instruments TW150F-3
Micropipette puller Sutter Instrument Company Model P-97 We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. Euronexia L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant  ThermoFisher Scientific P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm  Reda 41146-18
Parafilm  Heathrow Scientific HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15070063
Perforated spoon  Euronexia S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm  CELLSTAR 628160
Plastic transfer pipettes  ThermoFisher Scientific PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody BD Biosciences 555444 dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) Vector Laboratories RL-1042 This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody R&D systems AF4269 dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G BD microlance 301500
Streptavidin Alexa Fluor 405 ThermoFisher Scientific S32351 dilution 1:200
Syringe 5 mL BD Emerald 307731
Transparent tape  Tesa 4124 Available at most hardware stores
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia  ThermoFisher Scientific 010404.H2

References

  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).

Play Video

Cite This Article
Koning, M., Lievers, E., Jaffredo, T., van den Berg, C. W., Rabelink, T. J. Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (192), e65090, doi:10.3791/65090 (2023).

View Video